發(fā)布時間：2020-11-21 15:17

　　 研究目的肺纖維化是在肺部疾病中常見的一種典型的病理特征。硫化氫(H_2S)被認為是繼一氧化氮和一氧化碳之后氣體信號分子家族的第三個成員,它在包括炎癥,代謝紊亂和血壓調(diào)節(jié)等許多生理和病理生理過程中都起著極其重要的作用。我們前期的實驗結(jié)果表明,H_2S供體NaHS在在體和離體情況下都可以逆轉(zhuǎn)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中發(fā)生的細胞衰老從而改善肺纖維化。本研究的目的是深入了解H_2S通過抑制肺泡上皮細胞衰老改善肺纖維化的機制。研究方法構(gòu)建CBS基因敲除小鼠,通過WB檢測肺組織中P53、P21的表達,通過Masson染色觀察肺組織纖維化的程度,然后利用免疫熒光觀察肺組織中衰老相關(guān)蛋白P53、P21和SPC的共染情況。收集經(jīng)博來霉素干預(yù)過的L2細胞的上清液作用于小鼠成纖維細胞(NIH3T3)。運用WB檢測成纖維細胞中α-SMA和纖維黏連蛋白(Fibronectin)的蛋白表達,用PCR檢測成纖維細胞中增殖特異性基因Aurkb、Ccnb1、Cdc25b和Foxm1 mRNA的表達。為了了解P53在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中的關(guān)鍵作用,使用P53抑制劑和硫化氫處理L2細胞,通過檢測細胞中的P21蛋白表達和SA-β-gal衰老染色了解細胞衰老的情況。通過免疫共沉淀了解P53和MDM2之間的相互作用以及H_2S處理后P53的泛素化降解情況。最后對經(jīng)過BLM和H_2S處理過的小鼠肺組織進行硫巰基化處理,明確H_2S的硫巰基化作用。研究結(jié)果1)H_2S合成酶CBS敲除使小鼠肺內(nèi)P53和P21表達增加并誘導(dǎo)肺纖維化;2)H_2S供體NaHS抑制ATII細胞和成纖維細胞之間的相互作用;3)P53抑制劑抑制P53/P21和SASP基因的表達減輕L2細胞衰老;4)H_2S通過硫巰基化增強MDM2和P53的相互作用及P53的泛素化降解。研究結(jié)論H_2S可以抑制NIH3T3的異常增殖,并通過使MDM2硫巰基化促進P53泛素化降解來改善細胞衰老從而逆轉(zhuǎn)肺纖維化。
【學(xué)位單位】：上海體育學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R563
【部分圖文】：

硫化氫通過硫巰基化MDM2抑制肺上皮細胞衰老從而改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化224.統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以用均值±標準誤（SD±SEM）形式表示，使用SPSS20.0分析數(shù)據(jù)。組間比較運用單因素方差分析（ANOVA）方法，P＜0.05代表有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。5.研究結(jié)果5.1H2S合成酶CBS敲除可誘導(dǎo)II型肺上皮細胞衰老和肺纖維化如前所述，博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中衰老標志物P53、P21的表達隨時間延長顯著增加，而H2S合成酶CBS和CSE的表達都隨時間的表達而減少，這表明博來霉素可以誘導(dǎo)小鼠肺組織細胞的衰老和內(nèi)源性H2S的減少。為了明確組織的衰老和H2S的減少是否有直接關(guān)系，我們構(gòu)建了CBS敲除小鼠以研究兩者之間的關(guān)系。在這部分實驗中，我們將動物分成兩組：野生型組和CBS基因部分敲除兩組。圖1-1H2S合成酶CBS敲除后肺纖維化形成注：圖為是Masson染色（標尺為50um）及氣CBS敲除后肺纖維化面積/肺實質(zhì)面積的比值，與Control相比，**P＜0.01。首先通過Masson染色觀察小鼠肺組織纖維化情況。結(jié)果表明CBS敲除后肺組織中藍色膠原沉淀明顯增多，肺泡壁的厚度亦明顯增加，這表明與野生型小鼠相比，CBS敲除小鼠肺組織的纖維化面積明顯增加。

CBS敲除后肺組織中P53/P21/CSE表達變化

硫化氫通過硫巰基化MDM2抑制肺上皮細胞衰老從而改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化24圖1-3CBS敲除誘導(dǎo)的小鼠肺組織衰老注：紅色熒光標記的是SPC(Cy3)，綠色熒光標記的是P53/P21(FITC)，藍色標記為細胞核（DAPI），圖中標尺為50um。P53/P21標記ATII細胞與ATII細胞總量比值，**P<0.01.更進一步的免疫熒光結(jié)果也顯示，CBS敲除的小鼠肺組織中P53和P21的含量明顯增高。5.2外源性H2S對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中P53/P21表達的影響
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本文編號：2893201