藍(lán)莓酒渣花色苷的提取及抗氧化活性研究
發(fā)布時(shí)間：2016-03-21 09:51
第一章 緒論
1.1.1 藍(lán)莓種類
藍(lán)莓主要分布區(qū)域在北半球的溫帶和亞熱帶，全球共有藍(lán)莓品種約 400 余種。中國(guó)約有 100 余種藍(lán)莓品種及其變種，分布地區(qū)集中在西南和東北一帶。我國(guó)主要栽培品種有三類，即高叢藍(lán)莓（Vac-cinium corymbosum）、矮叢藍(lán)莓（Vaccinium chamaebuxus）和兔眼藍(lán)莓（Vaccinium ashei）[3-4]。高叢藍(lán)莓又可分為北高叢藍(lán)莓、南高叢藍(lán)莓和半高叢藍(lán)莓，它的種植面積是目前世界人工種植面積最大的藍(lán)莓品種，在北溫帶和亞熱帶是其商業(yè)種植的集中區(qū)域。其中北高叢藍(lán)莓適宜種植在北方，而南高叢藍(lán)莓適宜在南方種植，半高叢藍(lán)莓是高叢藍(lán)莓和矮叢藍(lán)莓的雜交品種，也適合種植在北方。矮叢藍(lán)莓在美國(guó)和加拿大分布廣泛，適宜栽植在北方寒冷地區(qū)[5]。兔眼藍(lán)莓的原產(chǎn)地位于北美洲，其生長(zhǎng)能力強(qiáng)、耐 pH值幅度大、休眠期短、需水期短，極其適合在我國(guó)南方地區(qū)推廣種植[6]。
1.1.2 藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)價(jià)值
藍(lán)莓是美國(guó)農(nóng)業(yè)部營(yíng)養(yǎng)研究中心研究過(guò)的多種水果蔬菜中抗氧化活性成分含量最高的。藍(lán)莓果肉細(xì)膩，富含維生素和多種礦物質(zhì)，已在藍(lán)莓漿果中檢測(cè)到了 19 種氨基酸，其中有 8 種是人體所需要的必需氨基酸[7]。每 100g 新鮮藍(lán)莓果中，有 400-700mg 的蛋白質(zhì)、500-600mg 的脂肪、12.3-15.3g 的碳水化合物、81-100 IU 的 VA，還有大量的多酚和黃酮類物質(zhì)，花色苷含量是其他植物的很多倍[8]。正因?yàn)樗{(lán)莓含有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，現(xiàn)如今各種藍(lán)莓制品已風(fēng)靡全球，成為人們?nèi)找嫱瞥绲谋＝∈称贰?br /> 1.1.3 藍(lán)莓分布利用情況
全球的越桔屬植物共有 400 余種，集中生長(zhǎng)于北半球的亞熱帶等地區(qū)。我國(guó)野生藍(lán)莓資源主要集中分布在吉林長(zhǎng)白山和黑龍江大、小興安嶺一帶，據(jù)估算我國(guó)野生藍(lán)莓的年產(chǎn)量約為 100 萬(wàn)噸，而藍(lán)莓加工廠年加工總量在 1000 噸以下，約為野生產(chǎn)量的 0.1%。
野生藍(lán)莓采摘困難且口感不好，一直以來(lái)沒(méi)有得到足夠的重視，但隨著藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)價(jià)值日益被人們所了解，現(xiàn)在野生藍(lán)莓的產(chǎn)量已經(jīng)變的供不應(yīng)求，這使藍(lán)莓的種植有了廣闊的發(fā)展空間�，F(xiàn)在種植藍(lán)莓的主要地區(qū)主要有長(zhǎng)白山、大小興安嶺，遼東、膠東半島，長(zhǎng)江地區(qū)和華南一帶[9-11]。
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花色苷是由花青素與糖結(jié)合而成，花青素的基本結(jié)構(gòu)是 3，5，7-三羥基-2-苯基苯并毗喃，也被叫做花色基元（見(jiàn)圖 1-1）�；ㄉ战Y(jié)構(gòu)中含有 C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，花色苷的配基能夠和糖結(jié)合形成配糖體。由于花青素極不穩(wěn)定，多數(shù)的 3，5，7 碳位被羥基取代，其它位置上的取代基也不相同，這樣花青素就分為很多種，自然界中以游離形式的花青素很少，多以花色苷的形式存在。現(xiàn)在已知的花青素一共有 6 種（見(jiàn)表 1-1）。能與花青素結(jié)合生成糖苷鍵的糖主要有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖等單糖，以及這些單糖形成的二糖或三糖，最常見(jiàn)的有 3-單糖苷、5-雙糖苷、3，5-二糖苷和 3，7-二糖苷[32]。
花色苷的提取方法有很多，常用的有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法和酶法輔助提取法等。其中最常用的是溶劑萃取法，不同原料中的花色苷種類和含量都不相同，所以通常根據(jù)目標(biāo)提取物的屬性來(lái)選擇何種提取方法。如果目的是為了定性、定量，那么提取方式不能破壞花色苷的結(jié)構(gòu)；如果目的是為了保持色素穩(wěn)定，當(dāng)做食品添加劑使用，則應(yīng)以提取率為指標(biāo)，減少顏色的變化并保持其穩(wěn)定性不變。
天然色素最常用的提取方法是溶劑提取法，溶劑提取法的關(guān)鍵是選擇合適的提取劑。選擇合適的提取劑，不僅要考慮到對(duì)目標(biāo)提取物應(yīng)有較大的溶解度，還要避免溶解大量雜質(zhì)，還應(yīng)對(duì)成本、安全性、對(duì)環(huán)境的污染和回收等因素加以考慮。有研究表明，在食品領(lǐng)域提取花色苷時(shí)，最好采用無(wú)毒的乙醇。由于花色苷在酸性條件下穩(wěn)定，用鹽酸酸化可以使提取液 pH 較低，能夠提高花色苷提取率，并保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。徐美玲等[35]用溶劑提取法提取藍(lán)莓果中的花色苷，提取率達(dá)到 5.8%。張學(xué)寧等[36]比較了水浴法、微波法和超聲波法對(duì)藍(lán)莓果實(shí)花色苷的最佳提取工藝，結(jié)果顯示：超聲波法適于北陸和喬治 2 個(gè)品種。
借助超聲波技術(shù)來(lái)提取花色苷，其原理是：超聲波的空化作用可以破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，使溶劑擴(kuò)散速率加快，最后可經(jīng)分離獲取目標(biāo)物質(zhì)，超聲波技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)很多，目前在中草藥提取方面應(yīng)用的最多[37-38]�；ㄉ諢岱�(wěn)定性極差，可以用超聲波輔助萃取來(lái)降低提取的溫度，避免花色苷在高溫時(shí)發(fā)生降解。李雙石等[39]應(yīng)用超聲波法萃取葡萄皮渣中的花色苷，結(jié)果花色苷的提取量又顯著的提高。陳鋼等[40]用超聲波提取黑莓果中的花色苷，結(jié)果表明，黑莓花色苷溶液還原力高于VC。
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第二章 藍(lán)莓酒渣花色苷提取工藝的研究
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2.2 試驗(yàn)方法
2.2.1 工藝流程藍(lán)莓酒渣→40℃烘干至恒重→粉碎過(guò) 60 目篩→提取液提取→抽濾→濾液定量測(cè)定
取一定量的藍(lán)莓酒渣粉在不同條件下提取，提取液過(guò)濾后定容到一定體積，稀釋一定倍數(shù)后，分別測(cè)量花色苷、總酚和總黃酮的吸光值，計(jì)算其提取量。
2.2.2 藍(lán)莓酒渣基本指標(biāo)測(cè)定
2.2.2.1 花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定
（1）pH 1.0 與 pH 4.5 緩沖溶液的配制：
精確稱取氯化鉀 0.373mg，溶于 25mL 蒸餾水中，在加入 1.107mL 濃鹽酸（體積分?jǐn)?shù)37%、濃度 12.1mol/L），混勻后即為 pH 1.0 的緩沖溶液，放入冰箱備用。
精確稱取 2.772g 三水合醋酸鈉，溶于 20mL 蒸餾水中，在加入 0.992mL 濃鹽酸（體積分?jǐn)?shù) 37%、濃度 12.1mol/L），混勻后在加入 30mL 蒸餾水，混勻后即為 pH 4.5 的緩沖溶液，放入冰箱備用。
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
花色苷(ACY)含量的測(cè)定采用 pH 示差法[121]，根據(jù)李安文[122]的方法進(jìn)行改進(jìn)。精確稱取 7.2mg 矢車菊素 3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，溶解后定容到 10mL 作為母液，分別稀釋到濃度為 0.012mg/mL、0.024mg/mL、0.036mg/mL、0.048mg/mL、0.072mg/mL，分別用 pH1.0 和pH4.5 的緩沖液定容至 10mL，分別在 520nm 與 700nm 處測(cè)定溶液的吸光度，代入公式 2-1計(jì)算吸光值 A，以濃度 C 為橫坐標(biāo)，吸光值 A 為縱坐標(biāo)繪制花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.2.2.2 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
參照蔡義忠等[123]的 Folin-Ciocalteu 比色法進(jìn)行多酚含量的測(cè)定。精確稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 10mg，用水溶解并定容到 100mL，得 0.1mg/mL 的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液 0、1、2、3、4、5mL 于 10mL 容量瓶中，各加 2mL 福林試劑，搖勻，4min 后，加入 7.5% Na2CO3溶液 2mL，用蒸餾水定容，充分混合后避光反應(yīng) 2h，在 760nm 波長(zhǎng)測(cè)定溶液吸光值 A，以濃度 C 為橫坐標(biāo)，吸光值 A 為縱坐標(biāo)繪制總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.2.2.3 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
總黃酮采用蘆丁為參比標(biāo)準(zhǔn)，用分光光度法測(cè)定[124]。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 10mg，用95%乙醇溶解后，配制成 0.2mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，放入冰箱備用。用移液槍分別準(zhǔn)確吸取貯備液 0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，置于 10mL 容量瓶中，分別加入 50%乙醇使成容量瓶中液體達(dá)到 5mL 后，加入 5% NaNO2溶液 0.3mL，6min 后加入 10%Al(NO3)3溶液 0.3mL，再過(guò) 6min 后加入 4 %NaOH 溶液 4mL，用 50%乙醇定容，搖勻后靜置 l5min，在 510nm 處分別測(cè)吸光值 A，以濃度 C 為橫坐標(biāo)，吸光值 A 為縱坐標(biāo)繪制總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.2.3 溶劑法提取藍(lán)莓酒渣中花色苷、總酚、總黃酮
將藍(lán)莓酒渣 40℃烘干，用高速粉碎機(jī)粉碎，粉末過(guò)不同目數(shù)的篩子，稱取 1g 酒渣，置于 100mL 錐形瓶中，在不同提取條件下提取后抽濾，濾液稀釋一定倍數(shù)后測(cè)量花色苷、總酚、總黃酮的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各物質(zhì)的提取量。對(duì)各工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，選擇對(duì)提取效率影響顯著的因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，通過(guò)正交分析，得出最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)。
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3.1 試驗(yàn)材料與儀器.......................................... 34
3.1.1 主要材料與試劑 ...................................... 34
3.1.2 試驗(yàn)儀器.............................................. 34
3.2 試驗(yàn)方法................................................. 34
3.4 結(jié)論 .................................................... 48
第四章 藍(lán)莓酒渣花色苷穩(wěn)定性研究 ...............................49
4.1 試驗(yàn)材料與儀器 ......................................... 49
4.1.1 主要材料與試劑 .................................... 49
4.1.2 主要儀器設(shè)備 ......................................... 50
第五章 藍(lán)莓酒渣花色抗氧化性研究 ..........................61
5.1 試驗(yàn)材料與儀器 ......................................... 61
5.1.1 主要材料與試劑 ..................................... 61
5.1.2 主要儀器設(shè)備 ..................................... 62
第五章 藍(lán)莓酒渣花色抗氧化性研究
在抗氧化等功能性食品的研發(fā)過(guò)程中，通常通過(guò)體內(nèi)和體外的抗氧化能力來(lái)衡量其抗氧化能力。由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)受到諸多條件的限制，所以體外實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的更加廣泛。通常體外抗氧化實(shí)驗(yàn)有 DPPH 法、羥基自由基清除法、抗超氧陰離子自由基清除法、ABTS 法和測(cè)定總抗氧化能力等方法。這些方法中每種方法都有各自的檢測(cè)意義，通過(guò)不同方法得出的數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性不大。本實(shí)驗(yàn)中采用了羥基自由基清除法、DPPH 法、抗超氧陰離子自由基清除法和總抗氧化能力的測(cè)定，對(duì)藍(lán)莓酒渣花色苷純化物和粗提物的抗氧化活性進(jìn)行比較。
5.2.1 藍(lán)莓酒渣花色苷對(duì)羥自由基的清除能力
參照 Blois 等[160]的方法略作改動(dòng)，，配制 0.2mmol/L 的 DPPH 溶液，放于棕色瓶中在 4℃冷藏保存，在比色管中加入不同濃度的藍(lán)莓酒渣花色苷溶液和 DPPH 溶液各 2mL，充分混合后在室溫避光下放置 30min，在 517nm 處測(cè)定溶液的吸光值�？瞻捉M為 1.5mL 乙醇溶液和 1.5mL 一定濃度的藍(lán)莓酒渣花色苷溶液；對(duì)照組為 1.5mL 乙醇溶液和 1.5mLDPPH 溶液，以 VC作為對(duì)照。清除率（E）計(jì)算公式如 5-2：
參照郭雪峰[161]方法略作改動(dòng)，依次加入濃度為50mmol/L Tris-HCl緩沖液5.7mL，樣品溶液0.2mL，濃度為6mmol/L鄰苯三酚溶液0.1mL，混合反應(yīng)4min，滴入2滴HCl終止反應(yīng)，在320nm處測(cè)量。根據(jù)公式5-3計(jì)算出單位時(shí)間內(nèi)吸光度值的變化，以VC作為對(duì)照。計(jì)算超氧陰離子的清除率公式如下：
二苯基苦味肼基自由基（DPPH）是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，可用來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的供氫能力，在517nm處有特征吸收峰，當(dāng)DPPH中加入的被測(cè)物質(zhì)中有抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑就會(huì)與孤對(duì)電子配對(duì)，使其在517nm處的吸光度值減小。因此可根據(jù)吸光度值的變化來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)DPPH自由基的清除能力[165]。
總抗氧化能力是物質(zhì)的不同活性成分清除各種類型自由基的有效和，抗氧化活性物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)起效果的是其總抗氧化能力，因此用總抗氧化能力(TAA)評(píng)價(jià)生物活性物質(zhì)的抗氧化功能是非常重要的指標(biāo)[167]。通常樣品中抗氧化物質(zhì)的含量與其總還原能力呈正相關(guān)，依據(jù)還原能力的測(cè)定原理，在波長(zhǎng) 700nm 處測(cè)定的吸光值越大，則樣品的還原能力越強(qiáng)。如圖 5-1-A 和 5-1-B 所示，在一定的濃度范圍內(nèi)，藍(lán)莓酒渣花色苷純化物和粗提物的還原能力隨質(zhì)量濃度的增加而增大，且藍(lán)莓酒渣花色苷的總抗氧化能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，說(shuō)明吸光度和質(zhì)量濃度基本上呈現(xiàn)正比關(guān)系；且在不同質(zhì)量濃度下，藍(lán)莓酒渣花色苷純化物的總還原能力均高于粗提物。但純化物和粗提物的總抗氧化能力均低于 VC，藍(lán)莓酒渣花色苷純化物和粗提物的濃度為 20μg/mL 時(shí)，吸光值分別為 0.139 和 0.083，VC的濃度為 20μg/mL 時(shí)，吸光值達(dá)到了 0.652，VC的總抗氧化能力是藍(lán)莓酒渣花色苷純化物的 4.7 倍和 7.5 倍。
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第六章 結(jié)論與建議
花色苷有抗癌、抗炎等作用，是目前食品的人們研究對(duì)象。本文創(chuàng)新性的從藍(lán)莓酒渣中提取花色苷，采用溶劑提取法提取野生和種植酒渣中花色苷、總酚和總黃酮含量的差異，并達(dá)到了較好的提取效果，并對(duì)野生藍(lán)莓酒渣粗提物通過(guò)大孔樹(shù)脂法進(jìn)行純化，并用反相高效液相色譜質(zhì)譜對(duì)藍(lán)莓酒渣花色苷進(jìn)行組成成分分析，對(duì)純化后的藍(lán)莓酒渣花色苷產(chǎn)品進(jìn)行穩(wěn)定性和抗氧化性研究，結(jié)果表明其穩(wěn)定性極差，但抗氧化性極強(qiáng)。
（1）溶劑提取法提取野生和種植兩種藍(lán)莓酒渣中花色苷的工藝參數(shù)，得到最佳的提取工藝參數(shù)。野生藍(lán)莓酒渣最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：提取劑為 40 %乙醇，添加 0.1 %的鹽酸，料液比 1：40，30℃提取 1 h，提取液中花色苷含量為 3.03 mg/g，總酚 4.52 mg/g，總黃酮 1.85mg/g，粗提物得率 22.1 %，花色苷純度 1.37 %。種植藍(lán)莓酒渣最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：提取劑為40 %乙醇，添加 0.1 %的鹽酸，料液比 1：30，30℃提取 1 h，提取液中花色苷含量為 2.14 mg/g，總酚 3.34 mg/g，總黃酮 1.37 mg/g，粗提物得率 17.6 %，花色苷純度 0.89 %，結(jié)果表明，野生藍(lán)莓酒渣中殘留花色苷、總酚和總黃酮含量均高于種植藍(lán)莓酒渣，粗提物得率和花色苷純度也由于種植藍(lán)莓酒渣。
（2）藍(lán)莓酒渣花色苷純化實(shí)驗(yàn)采用樹(shù)脂法對(duì)藍(lán)莓酒渣粗提物進(jìn)行純化。通過(guò)靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)比較 5 種型號(hào)的大孔樹(shù)脂對(duì)藍(lán)莓酒渣的吸附能力，結(jié)果顯示 NKA-II 型大孔樹(shù)脂對(duì)藍(lán)莓酒渣花色苷純化效果較好。NKA-II 型大孔樹(shù)脂對(duì)藍(lán)莓酒渣花色苷純化的工藝條件為：藍(lán)莓酒渣花色苷粗提液上樣濃度為 0.8mg/mL，pH 調(diào)整為 3，上樣流速為 1mL /min，洗脫劑為體積分?jǐn)?shù) 40%乙醇溶液，洗脫流速為 1.0mL/min。純化后藍(lán)莓酒渣花色苷產(chǎn)品為紫黑色粉末，色價(jià)為 90.57，純度為 27.6%。并從純化物中檢測(cè)出 5 種花色苷單體，推測(cè)為芍藥色素-3-半乳糖苷、飛燕草素-3-半乳糖苷、牽�；ㄉ�-3-半乳糖苷、錦葵色素-3 葡萄糖苷、錦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷。
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參考文獻(xiàn)（略）
本文編號(hào)：36399
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