人肝細胞可回復永生化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的初步研究
發(fā)布時間：2020-12-05 06:37
背景和目的:肝細胞材料已成為限制生物人工肝（bioartificial liver, BAL）及肝細胞移植（hepatocytes transplantation, HTX）發(fā)展的瓶頸問題,這一問題的解決必將大大提升BAL及HTX的臨床實用價值。理論上講,人肝細胞（包括成人肝細胞及人胎肝細胞）最為理想,但成人供肝來源極其有限且僅用于肝移植,加之成人肝細胞在體外增殖能力差,故大量獲得成人肝細胞是不可能的。胎肝的利用因涉及倫理問題,亦難以推廣應用。使用動物肝細胞又存在發(fā)生免疫反應及傳播動物病毒的危險。肝細胞株（如HepG2、C3A、HHY41、HepZ等）分化功能較原代肝細胞差,且多為瘤源性或由原代肝細胞經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染獲得,存在安全性問題。可回復性永生化程序為解決細胞材料問題提供了新的思路及手段。其基本原理是先將永生化基因猿猴病毒40大T抗原基因（simian virus 40 large T antigen gene, SV40T）導入原代細胞以獲得永生化細胞株,使其獲得體外增殖能力,然后再以特異性位點重組技術(shù)切除SV40T基因,使細胞株回復到永生化前的狀態(tài),這樣細胞既得到了增殖又不具有致癌...
【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學重慶市
【文章頁數(shù)】：76 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
可回復性永生化載體構(gòu)建新策略
14圖 1-1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLXSN 及其多克隆位點結(jié)構(gòu)組陽性克隆的鑒定R 法：在 20μl 反應體系中加入無菌水 19.2μl，2×PCR 混合液 10μl，2 引物各 0.4μl 使其終濃度為 1μM，用高壓滅菌牙簽或無菌吸頭沾取入反應體系中。反應條件：94℃預變性 5 分鐘；然后 94℃30s，58 30 個循環(huán)；最后 72℃延伸 10 分鐘。將 PCR 產(chǎn)物加到 1%瓊脂糖凝分離出 784bp 條帶者為陽性。切法：取 PCR 陽性克隆接種于 5ml 含 100U/ml 氨芐青霉素的 LB 培 250r/分鐘振蕩培養(yǎng)過夜。堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA，用 BamHⅠ和，1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，以 pLXSN 行相同雙酶切作為對照。
第三軍醫(yī)大學碩士學位論文述方法篩選的陽性克隆質(zhì)粒 DNA 進行測序分析，由上海生成，引物為 pLXSN 產(chǎn)品自帶測序引物 P5'。結(jié) 果態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率 質(zhì)粒 pUC18 轉(zhuǎn)化 50μl 感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化原液體積為 250μh 后，長出 1000 多個菌落（圖 1-2）。而受體菌對照平板未率約為 108轉(zhuǎn)化體/μg 超螺旋質(zhì)粒（轉(zhuǎn)化頻率=轉(zhuǎn)化體總數(shù)
【參考文獻】：
期刊論文
[1]The development of a new bioartificial liver and its application in 12 acute liver failure patients[J]. Yi-Tao Ding Yu-Dong Qiu Zhong Chen Qing-Xiang Xu Qing Tang De-Cai Yu Hepatobiliary Surgery Department,affiliated Drum Tower Hospital of Medical College of Nanjing University,Hepatobiliary Institute of Nanjing University;Hepatobiliary Surgery Institute of Nanjing,Jiangsu Province,210008,China He-Yuan Zhang Biochemistry Department in Nanjing University,Jiangsu Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2003(04)
[2]應用以菌落為模板的聚合酶鏈反應技術(shù)篩選重組陽性克隆[J]. 生秀杰,周偉強,姜莉,王太一,張學. 中華檢驗醫(yī)學雜志. 2002(04)
[3]SV40誘導髁突軟骨細胞永生化的實驗研究[J]. 段小紅,吳軍正,毛勇,李峰,楊彤元. 中華口腔醫(yī)學雜志. 2001(01)
[4]人工肝生物成分的研究進展[J]. 陳耀凱,王宇明. 中華實驗外科雜志. 2000(05)
[5]Cultivation of human liver cell lines with microcarriers acting as biological materials of bioartificial liver[J]. GAO Yi; XU Xiao-Ping; HU Huan-Zhang and YANG Ji-Zhen. World Journal of Gastroenterology. 1999(03)
[6]Experimental study of bioartificial liver with cultured human liver cells[J]. WANG Ying Jie, LI Meng Dong, WANG Yu Ming, NIE Qing He and CHEN Guo Zheng. World Journal of Gastroenterology. 1999(02)
本文編號：2899048
【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學重慶市
【文章頁數(shù)】：76 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
可回復性永生化載體構(gòu)建新策略
14圖 1-1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLXSN 及其多克隆位點結(jié)構(gòu)組陽性克隆的鑒定R 法：在 20μl 反應體系中加入無菌水 19.2μl，2×PCR 混合液 10μl，2 引物各 0.4μl 使其終濃度為 1μM，用高壓滅菌牙簽或無菌吸頭沾取入反應體系中。反應條件：94℃預變性 5 分鐘；然后 94℃30s，58 30 個循環(huán)；最后 72℃延伸 10 分鐘。將 PCR 產(chǎn)物加到 1%瓊脂糖凝分離出 784bp 條帶者為陽性。切法：取 PCR 陽性克隆接種于 5ml 含 100U/ml 氨芐青霉素的 LB 培 250r/分鐘振蕩培養(yǎng)過夜。堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA，用 BamHⅠ和，1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，以 pLXSN 行相同雙酶切作為對照。
第三軍醫(yī)大學碩士學位論文述方法篩選的陽性克隆質(zhì)粒 DNA 進行測序分析，由上海生成，引物為 pLXSN 產(chǎn)品自帶測序引物 P5'。結(jié) 果態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率 質(zhì)粒 pUC18 轉(zhuǎn)化 50μl 感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化原液體積為 250μh 后，長出 1000 多個菌落（圖 1-2）。而受體菌對照平板未率約為 108轉(zhuǎn)化體/μg 超螺旋質(zhì)粒（轉(zhuǎn)化頻率=轉(zhuǎn)化體總數(shù)
【參考文獻】：
期刊論文
[1]The development of a new bioartificial liver and its application in 12 acute liver failure patients[J]. Yi-Tao Ding Yu-Dong Qiu Zhong Chen Qing-Xiang Xu Qing Tang De-Cai Yu Hepatobiliary Surgery Department,affiliated Drum Tower Hospital of Medical College of Nanjing University,Hepatobiliary Institute of Nanjing University;Hepatobiliary Surgery Institute of Nanjing,Jiangsu Province,210008,China He-Yuan Zhang Biochemistry Department in Nanjing University,Jiangsu Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2003(04)
[2]應用以菌落為模板的聚合酶鏈反應技術(shù)篩選重組陽性克隆[J]. 生秀杰,周偉強,姜莉,王太一,張學. 中華檢驗醫(yī)學雜志. 2002(04)
[3]SV40誘導髁突軟骨細胞永生化的實驗研究[J]. 段小紅,吳軍正,毛勇,李峰,楊彤元. 中華口腔醫(yī)學雜志. 2001(01)
[4]人工肝生物成分的研究進展[J]. 陳耀凱,王宇明. 中華實驗外科雜志. 2000(05)
[5]Cultivation of human liver cell lines with microcarriers acting as biological materials of bioartificial liver[J]. GAO Yi; XU Xiao-Ping; HU Huan-Zhang and YANG Ji-Zhen. World Journal of Gastroenterology. 1999(03)
[6]Experimental study of bioartificial liver with cultured human liver cells[J]. WANG Ying Jie, LI Meng Dong, WANG Yu Ming, NIE Qing He and CHEN Guo Zheng. World Journal of Gastroenterology. 1999(02)
本文編號：2899048
本文鏈接：http://www.wukwdryxk.cn/yixuelunwen/binglixuelunwen/2899048.html
最近更新
教材專著
