發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 03:17

　　 目的： 早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷(white matter damage, WMD)被認(rèn)為是早產(chǎn)兒最主要也是最重要的腦損傷。WMD的關(guān)鍵性靶細(xì)胞是少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。最近有學(xué)說指出WMD的發(fā)病機(jī)制中存在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化障礙。流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明宮內(nèi)感染是早產(chǎn)兒WMD發(fā)生的主要因素之一。神經(jīng)免疫應(yīng)答反應(yīng)被認(rèn)為在宮內(nèi)感染和早產(chǎn)兒WMD中起重要的介導(dǎo)作用。但具體的分子機(jī)制目前還不明確。 Toll樣蛋白的研究是近年來炎癥信號(hào)傳導(dǎo)領(lǐng)域取得的最重要進(jìn)展。Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)激活后通過誘導(dǎo)一系列炎性相關(guān)因子的表達(dá)調(diào)控機(jī)體固有性免疫應(yīng)答,并最終激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答。研究指出TLR-4信號(hào)通路參與缺血性腦梗塞、腦挫傷、帕金森氏病、蛛網(wǎng)膜下腔出血、多發(fā)性硬化、缺氧性腦損傷等一系列免疫應(yīng)答相關(guān)性腦損傷的發(fā)生。因此有學(xué)者提出：神經(jīng)免疫應(yīng)答過程中小膠質(zhì)細(xì)胞TLR-4信號(hào)的表達(dá)啟動(dòng)在腦內(nèi)防御反應(yīng)及腦損傷的平衡機(jī)制中起重要作用。最新的研究還指出TLR-4信號(hào)能直接激活經(jīng)典的notch1信號(hào)通路分子。而Notch1信號(hào)通路通過其下游目的基因Hes (Hairy enhancer of split)基因家族(如Hes1、Hes5等)對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化起到重要的負(fù)性調(diào)控作用。 目前國內(nèi)外對(duì)于TLR-4信號(hào)在宮內(nèi)感染致WMD發(fā)生中作用的研究不多,且多集中在離體水平上。過去幾年間,我們實(shí)驗(yàn)室通過子宮頸內(nèi)接種大腸桿菌的方式成功建立了宮內(nèi)感染致新生大鼠WMD的動(dòng)物模型�；�于這一成熟模型,本研究觀察宮內(nèi)感染后仔鼠腦內(nèi)TLR-4信號(hào)分子表達(dá)。并通過檢測相關(guān)下游細(xì)胞因子、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化負(fù)性調(diào)控因子,進(jìn)一步探討TLR-4信號(hào)在宮內(nèi)感染致WMD中的作用機(jī)制。該研究為臨床治療早產(chǎn)兒WMD提供豐富的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)信息及依據(jù),為今后相關(guān)領(lǐng)域深入研究奠定整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),并為進(jìn)一步研究早產(chǎn)兒WMD的防治提供新的靶點(diǎn)。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)分組：將孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、宮內(nèi)感染組。宮內(nèi)感染組孕齡15天的孕鼠宮頸左右兩側(cè)各注射大腸桿菌稀釋液0.2 ml,對(duì)照組同孕齡孕鼠注入等量生理鹽水。 2.標(biāo)本采集：選擇17、19、21天胎齡和新生1、3、7、14日齡為觀察時(shí)點(diǎn),剖腹取出胎鼠或者隨機(jī)選取各組新生仔鼠斷頭處死,取出腦組織置于10%中性甲醛或液氮速凍后-80℃超低溫冰箱中冷凍保存。 3.實(shí)驗(yàn)方法：測定各時(shí)點(diǎn)仔鼠體重、腦重。應(yīng)用蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色觀察各組新生1、3、7、14日齡大鼠腦室周圍白質(zhì)組織病理變化特點(diǎn)。Western blot檢測各時(shí)點(diǎn)仔鼠腦組織髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)、TLR-4和核因子kappa B p65 (nuclear factor-kappa B p65, NF-κB p65)的蛋白表達(dá)水平,熒光定量RT-PCR檢測各時(shí)點(diǎn)仔鼠腦內(nèi)TLR-4、NF-κB p65、細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α.白細(xì)胞介素(interieukin, IL)-1β、Notch1、Hes5 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1.44只孕鼠活動(dòng)、進(jìn)食均正常,無1例發(fā)生死亡、早產(chǎn)。仔鼠情況：對(duì)照組獲取新生仔鼠66只,17、19、21天胎齡仔鼠56、55、58只,死產(chǎn)2只,死胎7只；宮內(nèi)感染組獲取新生仔鼠70只,17天、19天、21天胎齡仔鼠57、58、56只,死產(chǎn)5只,死胎8只。 宮內(nèi)大腸桿菌感染的孕鼠子宮壁及胎盤內(nèi)血管充血、水腫,并見大量中性粒細(xì)胞浸潤。對(duì)照組的孕鼠子宮及病理檢測均未見明顯的炎癥反應(yīng)。 2.宮內(nèi)感染后,各時(shí)點(diǎn)胎鼠及1日齡仔鼠體重、腦重下降. 3.7、14日齡仔鼠腦室周圍白質(zhì)部位HE染色可見：對(duì)照組腦白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)正常,染色清晰；宮內(nèi)感染組腦白質(zhì)染色淡,結(jié)構(gòu)稀疏呈篩網(wǎng)狀改變。 4.對(duì)照組14日齡仔鼠腦組織出現(xiàn)MBP表達(dá),宮內(nèi)感染組14日齡仔鼠腦組織MBP表達(dá)減少甚至消失。 5.宮內(nèi)感染后TLR-4及其下游信號(hào)分子NF-κB p65表達(dá)在17日胎齡及1、3、7日齡仔鼠腦內(nèi)同步化上調(diào)。 6.宮內(nèi)感染后19、21天胎齡仔鼠腦內(nèi)TNF-α表達(dá)上調(diào)。 7.宮內(nèi)感染后Notchl及其下游信號(hào)分子Hes5表達(dá)在19日胎齡及1、3、7日齡仔鼠腦內(nèi)同步化上調(diào)。 結(jié)論： 1.宮內(nèi)感染可使胎鼠體重、腦重下降。 2.TLR-4信號(hào)可能參與宮內(nèi)感染致WMD的發(fā)生。 3.TLR-4信號(hào)可能通過調(diào)控細(xì)胞因子的的表達(dá)部分介導(dǎo)宮內(nèi)感染后WMD的發(fā)生。 4.TLR-4信號(hào)在宮內(nèi)感染致腦白質(zhì)病變的發(fā)生中的作用可能部分源于激活的Notchl信號(hào)阻礙少突膠質(zhì)細(xì)胞前體分化。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R722.1
【部分圖文】：

圖1.6宮內(nèi)感染組和對(duì)照組新生鼠腦內(nèi)TLR一4mRNA表達(dá)水平比較**表示兩組比較，尸<0.01，*表示兩組比較，尸<0.05。P1P3P，E君。醒i心俱飛澳黝墓E龍。王呈公O幻t拍瑤ECO甄TL獲確aCtin42k今

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圖1.8宮內(nèi)感染組和對(duì)照組胎鼠腦內(nèi)NF一沼p65mRNA表達(dá)水平比較注:**表示兩組比較，尸<0.01，*表示兩組比較，尸<0.0510.0000卜1二contro}，2=e.coli自1.28.000卜6.0000一︵乙，︶書﹄‘O一.A.哎一N比E嬌dg2.0000一一村招招仁O口亡m名·﹂N一招﹄qe﹄砂U
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本文編號(hào)：2892438