發(fā)布時間：2020-11-05 00:05

　　 腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程非常復(fù)雜,機體中部分組織細胞受到致癌因素的影響,在基因水平失去正常調(diào)控生長的能力,發(fā)生異常増生致癌變。目前,外科手術(shù)仍然是治療惡性腫瘤的最常用的方法。原發(fā)腫瘤切除后,局部腫瘤復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移治療效果差。轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是惡性腫瘤患者死亡的最主要原因。術(shù)中無法完全避免癌細胞的播散、入血,麻醉及手術(shù)影響新陳代謝、神經(jīng)分泌因子,引起感染及免疫應(yīng)激,進而影響著惡性腫瘤術(shù)后的轉(zhuǎn)歸。乳腺癌,目前當(dāng)之無愧為女性最�；嫉膼盒阅[瘤之一,在女性患者中發(fā)病率已躍居第一,死亡率也僅僅低于位居第一的肺癌。隨著近些年來人們生活方式變化以及生存與生態(tài)環(huán)境的不斷惡化,每年新增乳腺癌病例高達3-4%的,且越來越呈現(xiàn)年輕化的趨勢。近年來,隨著圍手術(shù)期醫(yī)學(xué)得到越來越多的重視,麻醉藥物及方式與惡性腫瘤術(shù)中及術(shù)后的關(guān)系及影響逐漸成為新的熱點及關(guān)注對象。研究顯示,不同麻醉方案的實施可影響惡性腫瘤微環(huán)境,從而影響其發(fā)展。最新的研究提示,麻醉藥物亦可直接作用于惡性腫瘤病灶,研究涉及到氟烷、硫噴妥鈉、丙泊酚等少數(shù)麻醉藥物,而其他的全麻藥物及局麻藥物對惡性腫瘤轉(zhuǎn)歸的影響研究較少。因為是較新的研究領(lǐng)域,各家尚存在爭論。自古以來,科學(xué)總是在破與立中向前發(fā)展的,惡性腫瘤目前依然是醫(yī)學(xué)界乃至生命科學(xué)的難題,希望麻醉對于惡性腫瘤的影響的研究可以為惡性腫瘤的防治添磚加瓦。本實驗選用的局麻藥羅哌卡因(ropivacaine,RP),(S)-N-(2,6-二甲基苯基)-1-丙基-2哌啶羧酰胺,為純左旋(S)-對映異構(gòu)體,是臨床工作中在椎管內(nèi)麻醉及周圍神經(jīng)阻滯中最常選取的局麻藥。現(xiàn)有的研究顯示,局麻藥對于惡性腫瘤病人的預(yù)后有積極的影響,而國內(nèi)對羅哌卡因在抗腫瘤方面的研究還很少,局麻藥尚存在諸多未被發(fā)現(xiàn)的有益之處,等待我們對其進行更深入的研究。目的本研究首先觀察羅哌卡因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細胞增殖、凋亡、侵襲及遷徙的影響,進而又建立了人乳腺癌MCF-7細胞移植瘤模型,觀察羅哌卡因作用下乳腺癌移植瘤的生長、形態(tài)學(xué)變化以及在分子水平影響,最后觀察了臨床手術(shù)麻醉中使用羅哌卡因后對乳腺癌患者預(yù)后的影響,為臨床手術(shù)麻醉中選擇對乳腺癌患者更適合的麻醉方式及藥物提供新的科學(xué)依據(jù)。本研究共分以下三個部分。第一部分羅哌卡因?qū)θ橄侔┘毎�增殖、凋亡、侵襲及遷徙的影響方法1.MTT法檢測不同濃度的羅哌卡因(100μg/ml、200μg/ml及400μg/ml)孵育人乳腺癌MCF-7細胞12h后,對乳腺癌細胞增殖能力的影響,對照組用等量的生理鹽水。2.流式細胞技術(shù)檢測不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細胞后,對乳腺癌細胞周期的影響。3.微管示蹤法觀察不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細胞后對乳腺癌細胞有絲分裂的影響。4.Hoechst 33258單染及Hoechst 33258/PI雙染法檢測不同濃度的羅哌卡因(同上)對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡與死亡的影響。5.Transwell小室法測定不同濃度的羅哌卡因(同上)對人乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力的影響。6.Western blotting法檢測不同濃度的羅哌卡因(同上)對人乳腺癌MCF-7細胞MMP-2蛋白與MMP-9蛋白的表達的影響,進而研究對其侵襲能力的影響。7.細胞劃痕法檢測不同濃度的羅哌卡因(同上)處理后對人乳腺癌MCF-7細胞的遷移的影響。8.微絲與線粒體示蹤法觀察不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細胞后對乳腺癌細胞微絲變化及線粒體數(shù)量的影響。結(jié)果1.MTT法檢測結(jié)果顯示,不同濃度的羅哌卡因(100μg/ml、200μg/ml及400μg/ml)對人乳腺癌MCF-7細胞的增殖有顯著的抑制作用(P0.05)。2.流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細胞后,乳腺癌細胞處于分裂期或為分裂期做準備的時期減少,而處于靜止期的細胞明顯增多,并與羅哌卡因的濃度有關(guān)(P0.05)。3.微管示蹤法顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細胞后,細胞有絲分裂相減少,并與羅哌卡因的濃度有關(guān),濃度越高有絲分裂相的減少越明顯(P0.05)。4.Hoechst 33258單染及Hoechst 33258/PI雙染法檢測結(jié)果顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細胞后,細胞的凋亡率升高,細胞的死亡率也升高,并隨羅哌卡因濃度升高而升高(P0.05)。5.Transwell小室法檢測顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細胞后,乳腺癌細胞穿過小室底部微孔濾膜背面每視野的細胞數(shù)明顯降低,減少程度與羅哌卡因濃度有關(guān)(P0.05)。6.Western blotting法檢測結(jié)果顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細胞后,細胞MMP-2蛋白及MMP-9蛋白表達量隨羅哌卡因的濃度升高而降低(P0.05)。7.細胞劃痕法檢測顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細胞后,相對愈合距離隨羅哌卡因濃度的升高而逐漸降低(P0.05)。8.微絲與線粒體示蹤法觀察顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細胞后,隨著羅哌卡因濃度的提高,微絲與線粒體的形態(tài)學(xué)改變朝著不利于腫瘤細胞運動的方向發(fā)展。第二部分羅哌卡因?qū)θ橄侔┮浦擦龅挠绊懛椒?.以30只BALB/c-nu裸鼠建立人MCF-7乳腺癌移植瘤模型,最終選取24只腫瘤最小徑在2 mmb10 mm范圍內(nèi)的裸鼠納入研究,隨機分為2組即對照組C’組、羅哌卡因處理組R’組,C’組在腫瘤周圍注射生理鹽水,1ml/次,R’組在腫瘤周圍注射2mg/ml羅哌卡因1ml/次,1次/d,連續(xù)15d。以后每隔三天測量腫瘤大小,給藥終止一天后結(jié)束測量,計算各組腫瘤體積,并取得平均值。給藥終止一天后處死各組裸鼠,選用頸椎脫位法。頸椎脫位法處死裸鼠后可完整的剖出人乳腺癌MCF-7細胞移植瘤組織,并量出最終腫瘤大小,后將其進行固定、包埋,也可放置于-80℃冰箱中保存待用。2.對移植瘤的體積進行測量,繪制生長曲線,觀察羅哌卡因?qū)σ浦擦錾�長的影響。3.蘇木素-伊紅(H.E)染色法,觀察羅哌卡因?qū)θ橄侔┮浦擦鲂螒B(tài)學(xué)的影響。4.免疫組織化學(xué)染色法,觀察羅哌卡因?qū)θ橄侔┮浦擦錾掀?間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達的影響。5.免疫熒光法,觀察羅哌卡因?qū)θ橄侔┮浦擦錾掀?間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達的影響。6.Western blot檢測羅哌卡因?qū)θ橄侔┮浦擦鯰GF-β、VEGF、MMP-9表達的影響。結(jié)果1.測量移植瘤體積,繪制生長曲線顯示,R’組較C’組乳腺癌移植瘤生長明顯緩慢(P0.05)。2.蘇木素-伊紅(H.E)染色法,觀察發(fā)現(xiàn)R’病理學(xué)改變向惡性程度減低方向發(fā)展。3.免疫組織化學(xué)染色法觀察顯示,R’組E-鈣粘素呈強表達,波形蛋白表達較弱,HIF-1α表達較弱。4.免疫熒光法觀察顯示,R’組E-鈣粘素表達較強,波形蛋白表達較弱。5.Western blot檢測顯示,與C’組相比,R’組乳腺癌移植瘤TGF-β、VEGF、MMP-9的表達顯著減弱(p0.05)。第三部分羅哌卡因局部浸潤麻醉聯(lián)合胸肌神經(jīng)阻滯及切口持續(xù)浸潤鎮(zhèn)痛對乳腺癌患者預(yù)后的影響方法1.68例接受乳腺癌根治術(shù)的患者,隨機分為兩組,常規(guī)組(G組)和實驗組(E組),各包括34例患者。G組采用喉罩全憑靜脈麻醉及自控靜脈鎮(zhèn)痛(PCIA),E組采用羅哌卡因局部浸潤麻醉聯(lián)合胸肌神經(jīng)阻滯復(fù)合喉罩全憑靜脈麻醉及切口持續(xù)浸潤鎮(zhèn)痛。在手術(shù)前(T_0)、手術(shù)開始時(T_1)、手術(shù)1.5h時(T_2)、手術(shù)結(jié)束時(T_3)及術(shù)后3天(T_4)4個時間點,抽取每位患者6ml靜脈血,獲取全血與血漿分別置于EDTA管中,后保存于-80℃冰箱。2.兩組患者均在T_0、T_1、T_2、T_3及T_4時間點應(yīng)用高效液相層析法測定PRL、GH、IL-8、皮質(zhì)醇(Cor)的水平,獲知機體應(yīng)激反應(yīng)變化。3.兩組患者均在T_0、T_1、T_2、T_3及T_4時間點采用流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞型(CD_3~+、CD_4~+和CD_8~+)及NK細胞,比較CD_3~+T淋巴細胞百分比和CD_4~+/CD_8~+比值,揭示患者免疫功能變化。4.兩組患者均采用ELISA法檢測T_0、T_1、T_2、T_3及T_4時間點VEGF-C和TGF-β的變化。5.術(shù)后記錄兩組患者腫瘤大小,是否接受化療、放療及內(nèi)分泌治療,計算諾丁漢預(yù)后指數(shù)(NPI)。兩組患者均隨訪36個月,并記錄復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及接受治療情況。結(jié)果1.腫瘤大小、分級及預(yù)后因素兩組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。兩組均在諾丁漢預(yù)后指數(shù)評分中間范圍內(nèi)。此外,初始手術(shù)治療后化療,放射治療和內(nèi)分泌治療的發(fā)生率在兩組之間沒有顯著差異(p0.05)2.兩組PRL T_0最低,T_1最高、T_2-T_4逐漸降低,E組明顯低于G組(p0.05);GH在T_1-T_2逐漸升高,T_3-T_4逐漸降低,且E組明顯低于G組(p0.05);IL-8在T_1-T_4逐漸降低,且E組明顯低于G組(p0.05);Cor在T_1-T_2逐漸升高,T_3-T_4逐漸降低,且E組明顯低于G組(p0.05)。3.T_0時G組和E組的靜脈血中的CD_3~+T淋巴細胞百分比無顯著性差別。T_1時G組的CD_3~+T淋巴細胞百分比明顯低于E組(p0.05)。T_2、T_3時間點G組的CD_3~+T淋巴細胞百分比低于E組(p0.05)。T_4時間點時G組和E組的CD_3~+T淋巴細胞百分比均有不同程度的上升,但仍低于術(shù)前水平。E組CD_3~+T淋巴細胞百分比仍高于G組(p0.05)。兩組CD_4~+/CD_8~+比值在術(shù)前無明顯差異,在T_1時兩組CD_4~+/CD_8~+比值均顯著降低(p0.05),且G組下降程度更甚于E組(p0.05)。T_2、T_3時間點CD_4~+/CD_8~+比值明顯下降,但E組比值仍高于G組(p0.05)。T_4時間點CD_4~+/CD_8~+比值明顯下降,但E組比值仍高于G組(p0.05)。同時,各組CD_4~+/CD_8~+比值在T_4時間點有不同程度的上升,但仍低于術(shù)前水平。此外,E組CD_4~+/CD_8~+比值仍高于G組(p0.05)。NK細胞在T_0-T_4無顯著變化,組間比較T_3-T_4時E組明顯高于G組(p0.05)。4.兩組患者VEGF-C、TGF-β比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。5.隨訪結(jié)果顯示E組共2位患者(6%)復(fù)發(fā),24個月與36個月無復(fù)發(fā)生存率均為94%;G組共復(fù)發(fā)8位患者(24%),24個月無復(fù)發(fā)生存率82%,36個月無復(fù)發(fā)生存率76%。兩組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。使用Kaplan-Meier進行分析,E組的復(fù)發(fā)時間較慢(p0.05)。結(jié)論1、羅哌卡因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細胞增殖、侵襲及遷徙有抑制作用,對人乳腺癌MCF-7細胞的凋亡有促進作用。2、羅哌卡因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細胞裸鼠移植瘤的生長有抑制作用,并可抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生,降低HIF-1α、TGF-β、VEGF及MMP-9的表達。3、羅哌卡因局部浸潤麻醉聯(lián)合胸肌神經(jīng)阻滯及切口持續(xù)浸潤鎮(zhèn)痛能夠減少應(yīng)激反應(yīng)、改善免疫抑制、在36個月的隨訪期間將復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險降低了四倍。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R614;R737.9
【部分圖文】：

圖 1-1 不同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔?MCF-7 細胞增活力的影響（*P<0.0**P<0.01 與對照組比較）.2 不同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔?MCF-7 細胞細胞周期的影響人乳腺癌MCF-7細胞作為惡性腫瘤細胞其增殖是比較旺盛的。對照組

羅哌卡因?qū)θ橄侔┘毎�增殖、凋亡、侵襲及遷徙的影響16圖1-2 不同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細胞細胞周期的影響（*P<0.05，**P<0.01與對照組比較）2.1.3 不同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔?MCF-7 細胞有絲分裂的影響人乳腺癌 MCF-7 細胞分別于對照組（C 組）、羅哌卡因 100μg/ml(R1 組)、羅哌卡因 200μg/ml 組(R2 組)、羅哌卡因 400μg/ml 組(R3 組)以不同濃度羅哌卡因處理后，加入微管示蹤劑，染色，并以 DAPI 復(fù)染，在顯微鏡下觀察細胞變化，結(jié)果顯示：隨著羅哌卡因濃度的不斷升高，R1、R2、R3 組細胞的有絲分裂相較對照組逐漸減少差異明顯，MCF-7 細胞有絲分裂相的減少與羅哌卡因的濃度有關(guān)，濃度越高有絲分裂相的減少越明顯（見圖 1-3）。圖 1-3 不同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔?MCF-7 細胞有絲分裂的影響

同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細胞細胞周期的影響（*P<與對照組比較）濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔?MCF-7 細胞有絲分裂的影響癌 MCF-7 細胞分別于對照組（C 組）、羅哌卡因 100μg/00μg/ml 組(R2 組)、羅哌卡因 400μg/ml 組(R3 組)以不同濃入微管示蹤劑，染色，并以 DAPI 復(fù)染，在顯微鏡下觀隨著羅哌卡因濃度的不斷升高，R1、R2、R3 組細胞的有減少差異明顯，MCF-7 細胞有絲分裂相的減少與羅哌卡高有絲分裂相的減少越明顯（見圖 1-3）。
【參考文獻】

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本文編號：2870809