發(fā)布時(shí)間：2018-09-07 20:47

【摘要】：研究背景： 據(jù)報(bào)道世界范圍內(nèi)約有15%-20%的育齡夫婦不能生育,且近半個(gè)世紀(jì)以來,由于環(huán)境、心理、社會(huì)等因素的影響,男性精子的數(shù)量和質(zhì)量出現(xiàn)了明顯下降的趨勢(shì),男女不育不孕的比例也由3：7上升到5：5,男性生殖健康正受到嚴(yán)重威脅。解脲支原體屬于條件致病微生物,可黏附在泌尿生殖道的黏膜及上皮細(xì)胞上,導(dǎo)致泌尿生殖道感染,并可從多方面影響男性生育能力,如通過干擾精子發(fā)生、影響精子代謝、影響精卵結(jié)合及生殖道局部免疫等機(jī)制,但其致男性不育的具體機(jī)制目前還不完全清楚。并有部分研究顯示解脲支原體對(duì)男性不育并無顯著的影響。由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)試劑和方法的不同,不同地區(qū)男性不育患者精液中解脲支原體檢出率差異很大,可高達(dá)5%-58%,而正常生育者攜帶率為3%-31%。 解脲支原體對(duì)精液質(zhì)量的影響同樣在以往的研究中未達(dá)到共識(shí),臨床研究表明,解脲支原體感染患者存在精子數(shù)量降低,精子畸形率增加,液化時(shí)間延長(zhǎng)及抗精子抗體陽性率上升等表現(xiàn),而有些研究卻得到了陰性結(jié)果。導(dǎo)致上述分歧可能與受試個(gè)體的數(shù)目、區(qū)域、社會(huì)背景有關(guān),解脲支原體不同生物群致病能力不同,也可能是原因之一。解脲支原體按照基因型不同,共分為2個(gè)生物群：biovar I和biovar II,研究顯示不同的生物群致病能力不同,biovar II可能與非淋菌性尿道炎、盆腔炎、宮頸炎、不良懷孕關(guān)系更加密切,解脲脲原體不同生物群與定植和感染的關(guān)系是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 活性氧主要由白細(xì)胞和精子產(chǎn)生并釋放,生理狀態(tài)下,對(duì)維系精子的正常功能起到了重要的作用,然而精液中活性氧水平異常增加,破壞氧化還原系統(tǒng)平衡,會(huì)造成精子膜結(jié)構(gòu)的氧化損傷,精子活動(dòng)力下降,影響精子獲能和頂體反應(yīng)的發(fā)生,并可攻擊精子核DNA,造成精子核DNA的損傷如染色體交聯(lián)、染色體缺失、堿基對(duì)修飾、單股和雙股DNA斷裂等,過多的活性氧還可誘導(dǎo)精子細(xì)胞凋亡,線粒體是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡最重要的細(xì)胞器,高水平的活性氧可破壞線粒體膜,引起細(xì)胞色素c的釋放,激發(fā)半胱氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng),觸發(fā)細(xì)胞凋亡。精液中活性氧的來源眾多,研究顯示感染可導(dǎo)致精液中活性氧的異常增加,然而迄今只有少數(shù)報(bào)道涉及某一特殊感染對(duì)精液中活性氧生成的影響。 研究目的： 1.調(diào)查研究解脲支原體及其生物群在不育和可生育人群中的感染率。 2.研究不同生物群解脲支原體感染對(duì)精子常規(guī)參數(shù),精子運(yùn)動(dòng)參數(shù),精子形態(tài)以及精液白細(xì)胞的影響；探討不同生物群解脲支原體感染與精液白細(xì)胞的關(guān)系及白細(xì)胞在解脲支原體感染影響精子參數(shù)中的作用。 3.進(jìn)一步研究不同生物群解脲支原體感染對(duì)精液中活性氧產(chǎn)生,精子膜的脂質(zhì)過氧化以及核DNA損傷的影響,并探討活性氧產(chǎn)生與精液白細(xì)胞的關(guān)系。 研究方法： 1.解脲支原體及其生物群在不育和可生育男性人群中的比例 對(duì)2012年7至2013年5就診于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的223例不育男性患者和146例可生育男性人群進(jìn)行研究,研究對(duì)象的選取均嚴(yán)格按照本文的篩選標(biāo)準(zhǔn),采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)解脲支原體在男性不育人群和可生育人群中的感染率,并撿出感染陽性患者,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法鑒定其生物群。 2.不同生物群解脲支原體感染對(duì)精子常規(guī)參數(shù),精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)和精液白細(xì)胞的影響及白細(xì)胞在其中的作用 采用手淫法收取精液,液化后,檢測(cè)精子密度、活力、精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)、白細(xì)胞、精子形態(tài)等參數(shù),采用國(guó)產(chǎn)WLJY-9000型彩色精子自動(dòng)分析系統(tǒng)分析,應(yīng)用計(jì)算機(jī)精子形態(tài)分析軟件結(jié)合人工判讀進(jìn)行分析,先后按照支原體感染種類和精液白細(xì)胞正常與否對(duì)所測(cè)標(biāo)本的上述指標(biāo)進(jìn)行分組比較。 3.不同生物群解脲支原體感染對(duì)精液中活性氧產(chǎn)生,精子膜的脂質(zhì)過氧化以及精子核DNA損傷的影響 以魯米諾為探針,運(yùn)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)精子活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平。分別采用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)精液中丙二醛(Malondial-dehyde, MDA)和總超氧化物歧化酶(Total Superoxide Dismutase, T-SOD)的濃度。采用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析檢測(cè)精子核DNA完整性,采用單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)精子核DNA斷裂損傷 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。率的比較使用卡方檢驗(yàn)；多組間的比較使用ANOVA analysis, LSD用于組間比較；兩組數(shù)據(jù)的比較使用t檢驗(yàn),結(jié)果表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。Levene's test被用作方差同源性檢驗(yàn),如方差不齊,使用Welch檢驗(yàn),組間比較采用Dunnett T3。P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.解脲支原體及其生物群在不育和可生育男性人群中的比例 (1)解脲支原體在不育和可生育男性人群中的比例 對(duì)223例我院就診的不育男性和146例可生育人群精液中的解脲支原體感染率檢測(cè),結(jié)果顯示雖然不育男性人群中的感染率為33.6%(75/223)較可育男性人群的感染率24.7%(36/146)有增高的趨勢(shì),但兩者之間未具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=3.379,P=0.066)。 (2)解脲支原體不同生物群在不育和可生育男性人群感染陽性標(biāo)本中的檢出率 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)解脲支原體感染陽性標(biāo)本兩種生物群的檢出率,結(jié)果顯示biovar II群在不育男性感染陽性標(biāo)本中的檢出率42.7%(32/75)顯著高于可生育人群陽性標(biāo)本中的檢出率22.2%(8/36),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=4.411,P=0.036)。 (3)解脲支原體不同感染類型在不育和可生育男性人群中的比例 在不育男性患者和可生育人群中分別有8例(10.7%)和3例(8.3%)被發(fā)現(xiàn)有混合感染(biovarⅠ和biovarⅡ同時(shí)存在),二者之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.148,P=0.700)。 2.不同生物群解脲支原體感染對(duì)精子常規(guī)參數(shù),精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)以及精液白細(xì)胞的影響及白細(xì)胞在其中的作用 (1)不同生物群解脲支原體感染對(duì)精子常規(guī)參數(shù),精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)以及精液白細(xì)胞的影響 按照感染類別將標(biāo)本劃分為biovarⅠ, biovar Ⅱ,混合感染和未感染組共4組,比較分析了4組的精液常規(guī)參數(shù)和運(yùn)動(dòng)參數(shù),結(jié)果顯示精子總活力在4組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)。其他參數(shù)諸如精子濃度,前向運(yùn)動(dòng)力雖然感染組較非感染組有降低的趨勢(shì),但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。組間比較結(jié)果顯示biovarⅡ感染組的精子濃度(59.25±49.21)以及biovarⅡ(54.95±16.21)和混合感染組(51.26×20.88)的總活力與未感染組(77.03±×43.97；66.29±×16.14)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.038；P0.001,P=0.005)。精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的分析結(jié)果顯示biovarⅡ感染組的曲線速度(Mean Curvilinear Velocity, VCL)(P0.001)、直線速度(Mean straight-line velocity, VSL)(P=0.002)、平均路徑速度(Mean Average Path, VAP)(P=0.024)、直線性(Mean Percentage Lineality, LIN)(P=0.009)、擺動(dòng)性(Swing, WOB)(P=0.004)以及混合感染組的VCL(P=0.017)、 VSL(P=0.007)、LIN(P=0.016)與未感染組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；biovar Ⅰ感染組與未感染組相比各參數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)biovar Ⅰ感染組71人中有12人精液白細(xì)胞增高,biovar Ⅱ感染組40人中有12人白細(xì)胞增高,混合感染組11人中有3人白細(xì)胞增高,未感染組258人中有25人白細(xì)胞增高。比較白細(xì)胞異常增加比率的結(jié)果顯示四組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=14.842,P==0.002)。組間結(jié)果比較顯示白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常增加比例在biovar II感染組與未感染組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=13.136,P0.001),而biovar I感染組和混合感染組與未感染組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.901,P=0.089；χ2=3.498,P=0.61),提示biovar II感染與精液中白細(xì)胞增加關(guān)系更加密切。 (2)精液白細(xì)胞異常增加對(duì)精子常規(guī)參數(shù)、運(yùn)動(dòng)參數(shù)以及精子形態(tài)的影響 白細(xì)胞異常組與白細(xì)胞正常組相比,精液常規(guī)參數(shù)中總活力、前向運(yùn)動(dòng)力和正常精子比率在兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008；P=0.005；P=-0.003)；精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)中VCL (P=0.023)、VSL (P=0.010)、VAP (P=0.011)、WOB(P0.001)在兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；精子形態(tài)異常率在兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P--0.008),其中頭部異常增加明顯(P=0.005)。以上結(jié)果提示白細(xì)胞異常增加可以導(dǎo)致精子質(zhì)量和運(yùn)動(dòng)能力的下降以及畸形精子的比率增加。 3.不同生物群解脲支原體感染對(duì)精液活性氧產(chǎn)生,精子膜的脂質(zhì)過氧化以及精子核DNA損傷的影響 (1)不同生物群解脲支原體感染對(duì)精液氧化還原系統(tǒng)及脂質(zhì)過氧化的影響 我們按感染分類先后比較了4組間的精液ROS、MDA和T-SOD水平,結(jié)果顯示ROS水平在biovar II感染組(2.66±0.85)、混合感染組(2.82±±1.37)與未感染組(1.944±0.79)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001,P=0.003)；而biovar I感染組(2.20±±0.94)與未感染組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.075)；MDA的檢測(cè)結(jié)果顯示biovar II感染組(1.25±0.61nmol/l)、混合感染組(1.30±0.61nmol/l)與未感染組(0.94±0.52nmol/l)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.004,P=0.040)；而biovar I感染組(1.05±±0.55)與未感染組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.226)；T-SOD檢測(cè)結(jié)果顯示biovar I (63.57±8.95), biovar II感染組(62.71±7.10),混合感染組(61.81±±7.62)雖然低于未感染(64.49±±7.23)組,4組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.556)。 (2)不同生物群解脲支原體感染對(duì)精子DNA氧化損傷的影響 使用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法對(duì)4組不同人群精子細(xì)胞染色質(zhì)完整性進(jìn)行分析比較,結(jié)果顯示biovar Ⅱ感染組的DNA碎片指數(shù)(DNA Fragmentation Index, DFI%)(22.59±7.59).高DNA可染性(High DNA Stainable, HDS%)(10.58±3.74)與未感染組(18.32±7.62；8.06±4.23)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.003；P=0.001)；混合感染組DFI%(23.44±4.89)與未感染組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.032),而HDS%(9.73±3.37)在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.181); biovar I感染組DFI%(20.03±7.21), HDS%(8.92±3.60)與未感染組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.155；P=0.175)。使用單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)精子核DNA損傷,結(jié)果顯示biovar M感染組(1.06±0.15)與未感染組(0.94±0.12)之間彗星尾距(Tail Moment, TM)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001),而biovarⅠ感染組(0.96±0.11)和混合感染組(1.05±0.15)與未感染組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.257,P=0.224)。 結(jié)論： 1.解脲支原體在不育男性人群中的感染率雖然較可生育男性人群高,但二者之間并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而解脲支原體陽性標(biāo)本中biovarⅡ生物群的檢出率在兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示biovarⅡ群感染可能與男性不育密切相關(guān)。 2.按感染類別分組進(jìn)行的精子參數(shù)比較研究顯示只有總活力在4組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,組間比較發(fā)現(xiàn)biovarⅡ感染組的精子濃度及biovarⅡ和混合感染組的總活力與未感染組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上的結(jié)果提示biovarⅡ較biovarI對(duì)精子參數(shù)影響更加顯著,主要體現(xiàn)在精子活力方面,比較精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的結(jié)果提示biovarⅡ感染組的VSL、VCL、VAP、LIN、WOB與未感染組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。主要涉及以下機(jī)制①解脲支原體的強(qiáng)粘附作用②感染致精液中活性氧增加,破壞精子膜結(jié)構(gòu)及引起線粒體膜電位的改變,影響精子的能量供應(yīng),降低精子活動(dòng)力。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常增加比例在biovarⅡ感染組與未感染組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以往研究顯示白細(xì)胞是精液中活性氧的一個(gè)重要來源,結(jié)合上述結(jié)果,推測(cè)biovarⅡ群感染所致的精液白細(xì)胞異常增加并產(chǎn)生過多的活性氧可能是導(dǎo)致精子活力下降的主要原因之一。 3.為了證實(shí)白細(xì)胞增加對(duì)精液質(zhì)量的影響,我們把精液標(biāo)本分為白細(xì)胞正常組和白細(xì)胞異常組,分別比較了兩組的精子常規(guī)參數(shù),運(yùn)動(dòng)參數(shù)以及精子形態(tài)。結(jié)果顯示精子常規(guī)參數(shù)中總活力、前向運(yùn)動(dòng)力和正常精子比率在兩組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)VCL、VSL、VAP、WOB白細(xì)胞異常組明顯低于白細(xì)胞正常組,白細(xì)胞異常組精子畸形率明顯增加,并以頭部畸形為主,提示精液中白細(xì)胞的異常增加可能導(dǎo)致精子質(zhì)量的顯著下降。 4.進(jìn)而我們研究比較了不同生物群解脲支原體對(duì)ROS產(chǎn)生的影響,結(jié)果顯示biovar II感染組和混合感染組的ROS水平與未感染組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。解脲支原體感染引起的活性氧增加主要有兩個(gè)來源,一方面,解脲支原體對(duì)精子最有毒害的代謝產(chǎn)物是H2O2和NH3。H2O2本身對(duì)精子是有害的,并且可以轉(zhuǎn)化成OH基自由基,而后者對(duì)細(xì)胞膜和DNA具有強(qiáng)毒性。除此之外脲原體磷脂酶A和C可以改變細(xì)胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致其完整性的損失并增加其滲透性。另一方面,解脲支原體(主要是biovar II群)感染可引起精液中白細(xì)胞異常增加,并產(chǎn)生過多的ROS。我們的結(jié)果提示biovar II群感染引起的精液白細(xì)胞異常增加可能是活性氧過量產(chǎn)生的最主要原因。MDA的檢測(cè)結(jié)果也驗(yàn)證了此觀點(diǎn),biovar II和混合感染組的MDA水平顯著增加,表明ROS所致的精子膜脂質(zhì)過氧化增加,流動(dòng)性下降,精子活動(dòng)能力降低。然而此次研究中精液T-SOD水平未在感染組和未感染組之間發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 5.精子DNA染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析實(shí)驗(yàn)中的DFI%, HDS%以及單細(xì)胞凝膠電泳中的TM值在biovar II感染組與未感染組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示biovar II群感染可引起精液白細(xì)胞增加,釋放過量ROS,破壞精子DNA的完整性,導(dǎo)致DNA的斷裂損傷增加,最終影響男性的生育能力,并可能導(dǎo)致孕后的不良后果。 創(chuàng)新之處： 1.揭示了不同生物群解脲支原體在不育和可生育男性人群中的分布,biovarⅡ群在男性不育人群感染陽性標(biāo)本中的檢出率顯著高于可生育人群。 2.比較研究了不同生物群解脲支原體對(duì)精子質(zhì)量和精液白細(xì)胞的影響,提出biovarⅡ群對(duì)精液質(zhì)量的影響更加明顯,尤其是精子總活力,同時(shí)biovarⅡ群感染可引起精液中白細(xì)胞的明顯增加。 3.從活性氧產(chǎn)生的角度,比較研究了不同生物群解脲支原體對(duì)ROS產(chǎn)生,精子膜脂質(zhì)過氧化以及精子核DNA斷裂損傷的影響,提出biovarⅡ群可增加精液中ROS水平,引起精子膜脂質(zhì)過氧化以及精子核DNA損傷,其機(jī)制可能與精液中白細(xì)胞增加有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R698.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陸珍鳳,周曉軍,石群立,姜少軍,印洪林;電鏡顯示解脲支原體感染后在精子的部位[J];電子顯微學(xué)報(bào);2005年04期

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本文編號(hào)：2229374