發(fā)布時間：2020-11-15 12:29

　　 研究背景及目的:常染色體顯性多囊腎病(autosomal-dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是最為常見的遺傳性致死性腎臟囊腫性疾病,由PKD1和PKD2基因發(fā)生突變導(dǎo)致。PKD1編碼多囊蛋白1(polycystin 1,PC1);PKD2編碼多囊蛋白2(polycystin 2,PC2)。PC1和PC2可定位于細(xì)胞的多種膜結(jié)構(gòu)上,如:細(xì)胞頂端膜的初級纖毛,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體膜和細(xì)胞基底側(cè)膜等,并對維持細(xì)胞膜正常生理功能至關(guān)重要。頂端基底細(xì)胞極性紊亂在ADPKD患者腎組織中十分常見,且與腎囊腫發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。頂端基底細(xì)胞極性的正常建立主要依賴于三種核心蛋白復(fù)合體:PAR復(fù)合體、Crumbs復(fù)合體和Scribble復(fù)合體。其中Scribble復(fù)合體包含Scribble、DLG和LGL等蛋白,在建立和維持細(xì)胞基底側(cè)面極性方面發(fā)揮重要作用。Scribble蛋白的N端含有16個富含亮氨酸的重復(fù)片段(leucine-rich repeats,LRR)結(jié)構(gòu)域,而在其C末端則含有4個PDZ(PSD95/DLG/ZO-1)結(jié)構(gòu)域,這些結(jié)構(gòu)域與Scribble蛋白生物學(xué)功能密切相關(guān)。研究表明,敲低斑馬魚scrib基因表達(dá)可導(dǎo)致其產(chǎn)生前腎囊腫表型,提示Scribble蛋白在調(diào)控腎囊腫形成方面具有重要作用,但其在ADPKD腎囊腫發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。近期研究發(fā)現(xiàn),Scribble可以通過活化Hippo通路上游LATS1/2激酶來影響YAP蛋白的磷酸化水平,從而調(diào)控YAP蛋白亞細(xì)胞定位。而在ADPKD患者腎組織中,Hippo通路活性受到抑制,降低了YAP蛋白的磷酸化水平,從而促使YAP蛋白由細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。研究表明,YAP蛋白在細(xì)胞核內(nèi)聚集與腫瘤進展相關(guān),但也有研究指出,細(xì)胞質(zhì)中YAP可通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路來抑制腫瘤細(xì)胞增殖。因此,探究細(xì)胞質(zhì)YAP和細(xì)胞核YAP在ADPKD腎囊腫形成中的作用具有重要意義。本研究擬探究Scribble和細(xì)胞質(zhì)YAP在腎囊腫形成中的重要作用,并闡明Scribble通過調(diào)控YAP蛋白亞細(xì)胞定位來影響ADPKD腎囊腫發(fā)生發(fā)展的具體機制。研究方法:(1)利用蛋白免疫印跡、免疫熒光和RT-PCR技術(shù),分別檢測ADPKD斑馬魚模型(pkd2 morphants)和細(xì)胞模型(小鼠Pkd2~(-/-)細(xì)胞系)中Scribble的表達(dá)及定位情況;通過顯微注射技術(shù)探究Scribble蛋白及其不同結(jié)構(gòu)域(Scribble-LRR和Scribble-PDZ)對pkd2 morphants前腎囊腫形成的調(diào)控作用。(2)利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建斑馬魚scrib突變體,觀察突變體魚是否存在多囊腎相關(guān)表型。(3)通過蛋白免疫印跡、免疫熒光和RT-PCR技術(shù)分別檢測Hippo通路分子(pLATS1、LATS1、pYAP和YAP)在斑馬魚scrib突變體和敲低Scribble的人腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況。(4)利用蛋白免疫印跡、免疫熒光和RT-PCR技術(shù),分別檢測pLATS1、LATS1、pYAP以及YAP在pkd2 morphants和Pkd2~(-/-)細(xì)胞系中的表達(dá)及定位情況;構(gòu)建Tg(Tolcdh17:yap-gfp)、Tg(Tolcdh17:yapS87A-gfp)和Tg(Tolcdh17:yapS87D-gfp)轉(zhuǎn)基因魚,觀察不同類型YAP蛋白(YAP、YAPS87A和YAPS87D)在斑馬魚前腎管上皮細(xì)胞中的定位情況;在pkd2 morphants中顯微注射過表達(dá)不同類型YAP蛋白,觀察其對pkd2 morphants前腎囊腫形成的影響;給予pkd2 morphants Verteprofin藥物干預(yù),觀察拮抗YAP蛋白進入細(xì)胞核后效應(yīng)對pkd2 morphants前腎囊腫形成的影響。(5)構(gòu)建斑馬魚lats1突變體和yap突變體,觀察突變體魚是否存在前腎囊腫表型。(6)在Pkd2~(-/-)細(xì)胞系中過表達(dá)Scribble腺病毒,觀察Scribble可否在ADPKD疾病背景下調(diào)控pLATS1、LATS1、pYAP和YAP蛋白表達(dá);在HEK293T細(xì)胞中分別過表達(dá)Scribble、Scribble-LRR和Scribble-PDZ,明確Scribble是通過哪一結(jié)構(gòu)域來調(diào)控YAP蛋白的細(xì)胞亞定位;利用morpholino技術(shù)構(gòu)建scrib morphants,并在scrib morphants中過表達(dá)不同類型YAP蛋白(YAP、YAPS87A和YAPS87D),觀察其對scrib morphants前腎囊腫形成的影響。結(jié)果:(1)Scribble在pkd2 morphants和Pkd2~(-/-)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。(2)免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn)Scribble定位于斑馬魚前腎管上皮細(xì)胞的基底側(cè)膜上,且Scribble可與PC2在細(xì)胞膜上共定位。(3)過表達(dá)Scribble和Scribble-PDZ可抑制pkd2 morphants前腎囊腫形成,而過表達(dá)Scribble-LRR不具有類似效應(yīng)。(4)斑馬魚scrib突變體具有前腎管增粗表型,而敲除scrib可促使pkd2 morphants前腎囊腫表型加重。(5)pLATS1和pYAP水平在scrib突變體和敲低Scribble的人腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),且免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)YAP蛋白在scrib突變體前腎管上皮細(xì)胞中由細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。(6)pLATS1和pYAP水平在pkd2 morphants和Pkd2~(-/-)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào);免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),在pkd2 morphants前腎管上皮細(xì)胞和Pkd2~(-/-)細(xì)胞中,細(xì)胞質(zhì)中YAP蛋白減少,細(xì)胞核內(nèi)YAP增多。(7)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),YAP和YAPS87D蛋白定位于轉(zhuǎn)基因魚前腎管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,而YAPS87A定位于細(xì)胞核內(nèi)。(8)過表達(dá)YAP和YAPS87D可抑制pkd2 morphants前腎囊腫形成,而過表達(dá)YAPS87A不具有類似效應(yīng);當(dāng)給予pkd2 morphants Verteprofin藥物處理時,其多囊腎相關(guān)表型不能得到有效緩解。(9)斑馬魚lats1突變體不具有多囊腎相關(guān)表型,但敲除lats1可促使pkd2 morphants前腎囊腫表型加重。(10)斑馬魚yap突變體具有前腎囊腫表型;過表達(dá)YAP和YAPS87D可抑制yap突變體前腎囊腫形成,而過表達(dá)YAPS87A不具有類似效應(yīng)。(11)在Pkd2~(-/-)細(xì)胞中過表達(dá)Scribble可有效提升pLATS1和pYAP表達(dá)水平。(12)過表達(dá)Scribble和Scribble-PDZ可提升pYAP表達(dá)水平,促使YAP蛋白從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中,而過表達(dá)Scribble-LRR不具有類似效應(yīng)。(13)scrib morphants具有前腎囊腫表型;過表達(dá)YAP和YAPS87D可抑制scrib morphants前腎囊腫形成,而過表達(dá)YAPS87A可促進scrib morphants前腎囊腫形成。結(jié)論:(1)Scribble和細(xì)胞質(zhì)YAP在ADPKD腎囊腫發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用;(2)Scribble和細(xì)胞質(zhì)YAP對斑馬魚前腎管發(fā)育以及前腎囊腫形成至關(guān)重要;(3)Scribble可通過調(diào)控YAP蛋白亞細(xì)胞定位來影響ADPKD腎囊腫的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：

三、實驗結(jié)果（一）頂端基底細(xì)胞極性蛋白相關(guān)基因在 Pkd2-/-細(xì)胞系中表達(dá)情況維持細(xì)胞正常頂端基底極性需要三大類蛋白復(fù)合體，其中包括 PAR 復(fù)合體（包括 PAR3，PAR6 和 CDC42 等），Crumbs 復(fù)合體（包括 Crumb3，PATJ 和 PLAS1 等）和 Scribble 復(fù)合體（包括 Scribble，DLG1 和 LGL1 等）。為探究這些細(xì)胞極性蛋白在ADPKD 中的表達(dá)情況，我們利用 RT-PCR 技術(shù)在小鼠 Pkd2-/-細(xì)胞系中檢測了這些極性蛋白 mRNA 水平的表達(dá)變化。檢測發(fā)現(xiàn)，與 Pkd2+/-細(xì)胞相比，Pkd2-/-細(xì)胞的 Pkd2mRNA 水平存在明顯下調(diào)，而編碼細(xì)胞極性蛋白的 Crumb3、Par6a、Par6b、Scrib、Lgl1 和 Dlg1 基因的 mRNA 表達(dá)水平均存在差異性表達(dá)，其中，Par6b，Scrib 和 Lgl1等基因的 mRNA 水平存在明顯的下調(diào)，而 Dlg1 基因的 mRNA 水平存在明顯的上調(diào)，提示細(xì)胞極性蛋白在 ADPKD 中存在差異性表達(dá)（圖 1-1）。

海軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文均存在差異性表達(dá)，提示 Scribble 復(fù)合體相關(guān)蛋白表達(dá)異常在 ADPKD 中尤為顯著。Scribble 蛋白作為 Scribble 復(fù)合體的核心蛋白，其表達(dá)情況需在 ADPKD 動物和細(xì)胞模型中進一步探究。1、Scribble 蛋白在小鼠 Pkd2-/-細(xì)胞系中低表達(dá)我們利用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測了Pkd2+/-和Pkd2-/-細(xì)胞中Scribble蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn) Scribble 在 Pkd2-/-細(xì)胞中存在顯著的表達(dá)下調(diào)（圖 1-2A, B）；為進一步驗證Scribble 蛋白的表達(dá)情況，我們利用免疫熒光技術(shù)也發(fā)現(xiàn)，Scribble 在 Pkd2-/-細(xì)胞中的表達(dá)量要明顯低于 Pkd2+/-細(xì)胞（圖 1-2C）。

圖 1-3：Scribble 蛋白在斑馬魚 pkd2 morphants 中低表達(dá)。綜上，我們通過多種實驗方法檢測發(fā)現(xiàn)，Scribble 蛋白在 ADPKD 動物和細(xì)胞中低表達(dá)。（三）Scribble 蛋白定位既往研究發(fā)現(xiàn)，Scribble 蛋白主要定位于細(xì)胞膜的基底側(cè)面上，為探究 Scrib白在斑馬魚前腎管上皮細(xì)胞中的定位情況，我們將細(xì)胞基底側(cè)膜標(biāo)記蛋白 Cdh Scribble 在斑馬魚的前腎管（Pronephric duct）和腸管（Gut）中共染，發(fā)現(xiàn) Cd Scribble 在斑馬魚的前腎管和腸管上皮細(xì)胞中存在共定位現(xiàn)象，提示 Scribble 蛋要定位于斑馬魚前腎管和和腸管上皮細(xì)胞的基底側(cè)膜上（圖 1-4）。
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本文編號：2884762