發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 21:34

　　 第一部分 人HuR蛋白在腎小管上皮細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用研究背景近年來(lái),由于亞洲地區(qū)糖尿病人群基數(shù)持續(xù)增多,糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)逐漸成為終末期腎臟疾病(End stage renal disease, ESRD)最常見(jiàn)的原因之一。根據(jù)美國(guó)腎臟病數(shù)據(jù)庫(kù)(USRDS)的統(tǒng)計(jì),美國(guó)人群的糖尿病腎病發(fā)病率近年來(lái)維持在較穩(wěn)定的水平,可能是由于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI或ARB)類(lèi)藥物的廣泛使用,但是進(jìn)展至ESRD的速度卻絲毫沒(méi)有放緩。由于國(guó)情不同以及發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性,各種作用相互交織,其病因以及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,最終均以不可逆的腎臟纖維化進(jìn)展至尿毒癥為結(jié)局。上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(Epithelial to Mesenchymal Transition, EMT)的發(fā)生與特定環(huán)境下某些生物學(xué)特征的改變密切有關(guān),外部環(huán)境發(fā)生改變時(shí),人體內(nèi)特定程序?qū)㈦S之發(fā)生轉(zhuǎn)化,使某些上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的間質(zhì)細(xì)胞,其生物學(xué)效應(yīng)也多種多樣,如在纖維化疾病,慢性炎癥過(guò)程,癌癥異位轉(zhuǎn)移,胚胎的發(fā)育以及組織重構(gòu)等等都發(fā)揮了重要作用。因?yàn)榘l(fā)生EMT過(guò)程中步驟繁多卻十分有序,其過(guò)程可以在某種程度上受到外界的高度調(diào)節(jié),同時(shí)產(chǎn)生多種致病因子,反之,許多生長(zhǎng)因子或致纖維化因子均能誘導(dǎo)其發(fā)生。RNA結(jié)合蛋白HuR是胚胎致死異常視覺(jué)家族(ELAV)中的一員,在許多疾病中廣泛表達(dá),由于其在腫瘤和炎癥中的地位和作用得到更多關(guān)注。研究表明HuR與腫瘤發(fā)生過(guò)程中的許多特征密切相關(guān),如原癌基因的激活,細(xì)胞周期調(diào)控失控導(dǎo)致的細(xì)胞不良增殖,細(xì)胞外基質(zhì)成分和各種致纖維化因子的異常增多,最終導(dǎo)致了器官纖維化。而在EMT的發(fā)生發(fā)展中同樣存在如間充質(zhì)基因的激活,細(xì)胞的異常增殖,生長(zhǎng)因子的過(guò)分增多等特征。本研究將通過(guò)HuR蛋白與糖尿病腎病EMT特征的關(guān)系來(lái)探討轉(zhuǎn)錄后調(diào)控糖尿病腎病中的作用,從而闡明HuR蛋白極可能是影響EMT發(fā)展以及糖尿病腎病進(jìn)展的重要因素。研究方法(1)選取病理診斷為糖尿病腎病的腎臟病理組織20例,正常腎臟組織10例。入院后所有患者簽署腎穿刺活檢知情同意書(shū),并經(jīng)過(guò)山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。同時(shí),選取雄性SD大鼠,分為正常組和糖尿病腎病組,使用鏈脲佐菌素(STZ)方法建立糖尿病腎病模型。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)及對(duì)比RNA結(jié)合蛋白HuR在正常和糖尿病腎病患者腎活檢組織,以及大鼠腎臟中的表達(dá)變化,特別是胞漿胞核的變化。同時(shí)觀察上皮表型蛋白E-cadherin, Cytokeratin及間質(zhì)表型蛋白a-SMA, Vimentin的表達(dá)變化。(2)體外實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)永生化的腎小管上皮細(xì)胞HK-2分別在正常對(duì)照組,高糖培養(yǎng)組,及等滲對(duì)照組培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),并且與第24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí)收獲細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。分別提取細(xì)胞胞漿,胞核以及全細(xì)胞中蛋白以用Westernblot方法檢測(cè)檢測(cè)高糖刺激前后細(xì)胞中HuR蛋白的變化及EMT相關(guān)表型蛋白表達(dá)含量,采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)高糖刺激前后HuR蛋白的移位變化。(3)免疫沉淀法檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白HuR與變化糖尿病腎病EMT相關(guān)蛋白c-fos,TGF-β1, Snail, CTGF蛋白的結(jié)合能力。根據(jù)人HuR mRNA基因編碼區(qū)序列,利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)4條針對(duì)HuR的siRNA (參照 http:// www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html),選擇出一條干擾效率最強(qiáng)的的shRNA轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞。(4)測(cè)定HuR干擾前后HuR與各因子mRNA結(jié)合水平,和對(duì)EMT相關(guān)蛋白及表型蛋白表達(dá)水平的影響。通過(guò)觀察高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化時(shí)相關(guān)因子及RNA結(jié)合蛋白HuR的變化,探討轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在糖尿病腎病小管間質(zhì)纖維化中的作用。研究結(jié)果(1)免疫組化結(jié)果顯示,在正常人及正常大鼠腎組織部分腎小管細(xì)胞胞核中有HuR蛋白的表達(dá),細(xì)胞漿中鮮有表達(dá)。在糖尿病腎病組織中,與正常組相比,人及大鼠DN組織中可見(jiàn)HuR在胞核及胞漿的表達(dá)均有明顯增加。細(xì)胞免疫熒光及、Vesternblot結(jié)果顯示,高糖刺激后HuR總蛋白較正常組及高糖組有所增加(p0.05),胞核中蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異,胞漿中HuR在刺激48小時(shí)后有顯著升高,但在72小時(shí)后水平有所恢復(fù)。(2) Westernblot結(jié)果顯示,上皮細(xì)胞表型蛋白E-cadherin, Cytokeratin表達(dá)下降,而間質(zhì)表型蛋白a-SMA, Vimentin有所上升,而高糖誘導(dǎo)的c-fos,TGF-β1, Snail,CTGF蛋白表達(dá)水平均有不同程度的升高,免疫沉淀法顯示四種蛋白與HuR蛋白結(jié)合能力各不相同。(3)行HuR干擾后,與高糖組相比,免疫沉淀法顯示HuR與EMT各功能蛋白mRNA結(jié)合水平顯著下降；Westernblot結(jié)果顯示E-cadherin水平有所上升(P0.05),而CK表達(dá)水平無(wú)明顯變化,a-SMA與Vim蛋白表達(dá)水平下降(P0.05)。EMT功能蛋白TGF-β1, Snail, CTGF均有不同程度的表達(dá)下降,c-fos由于其特性的不同其表達(dá)在高糖刺激前后及HuR干擾前后上升或下降的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)論由于RNA結(jié)合蛋白HuR的特殊生物學(xué)結(jié)構(gòu)近特性,使其可能通過(guò)穩(wěn)定EMT相關(guān)基因的mRNA,從而使其表達(dá)增多而在器官纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。HuR及EMT的相關(guān)表型蛋白在糖尿病腎病早期表達(dá)明顯增高,干擾HuR后功能蛋白水平顯著下調(diào),提示HuR是否可以作為DN早期的診斷指標(biāo)并且可能通過(guò)降低各種致纖維化因子的轉(zhuǎn)錄后水平來(lái)影響DN中小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。當(dāng)然,HuR在糖尿病腎病中的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚待進(jìn)一步研究,但HuR蛋白有望成為即腫瘤之后糖尿病腎病診斷及疾病進(jìn)展的一種理想標(biāo)志物,從而為器官纖維化的治療提供新靶點(diǎn),為糖尿病腎病患者治療決策提供理論依據(jù)。第二部分 HuR在AngII刺激系膜細(xì)胞增殖中的影響研究背景腎小球系膜細(xì)胞(Human mesangial cells,HMCs)異常增殖作為一個(gè)顯著特征可以存在于不同病理類(lèi)型的慢性腎臟病中,這種異常增殖常常受到腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活的影響,在多種慢性腎臟病損傷以及疾病進(jìn)展中起到重要作用,如在糖尿病腎病,IgA腎病,狼瘡性腎炎中常常作為判斷活動(dòng)性病變的首要評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)是RAAS中最主要的效應(yīng)因子,其不僅可以影響腎小球血流動(dòng)力學(xué),更會(huì)刺激腎小球中的固有細(xì)胞引發(fā)異常增殖過(guò)程,并伴隨過(guò)多細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生。CyclinD1是最主要的調(diào)節(jié)G1/S期的周期蛋白,是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)良好指標(biāo)。HuR屬ELAV家族中一員,可調(diào)節(jié)mRNAs穩(wěn)定性及翻譯,在不同細(xì)胞中起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的作用。正常的細(xì)胞增殖需要CyclinD1的表達(dá),但是CyclinD1得過(guò)度表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞過(guò)度增殖作最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)的大量產(chǎn)生及最終腎小球纖維化等后果。觀察人抗原R(human antigen R, HuR)在血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ, AngⅡ)激活下人系膜細(xì)胞(HMC)增殖中的作用,探討轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對(duì)慢性腎臟病細(xì)胞異常增殖的影響。因Cyclin D1 mRNA在3’UTR含有許多的AREs序列,可以被含有AREs-binding的結(jié)合蛋白如HuR蛋白結(jié)合,而RNA結(jié)合蛋白HuR在AngⅡ刺激下的系膜細(xì)胞增殖中的作用仍不清楚。因此,本研究將通過(guò)觀察HuR蛋白表達(dá)變化,進(jìn)一步闡述在慢性腎臟病中的作為初始環(huán)節(jié)的系膜細(xì)胞增殖過(guò)程中是否存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的機(jī)制,從而使我們更好的認(rèn)識(shí)慢性腎臟病的疾病進(jìn)程,為延緩進(jìn)入終末期腎臟病提供理論依據(jù)。研究方法(1)體內(nèi)部分：選取正常人群以及不同水平系膜細(xì)胞增殖的慢性腎臟病如糖尿病腎病,狼瘡性腎病,IgA腎病,紫癜性腎炎,原發(fā)性膜性腎病患者腎臟活檢組織各5例,調(diào)閱病歷,排除血漿AngⅡ水平在正常值范圍內(nèi)的患者,被確診為以上疾病的患者血漿AngⅡ水平均高于正常值(請(qǐng)見(jiàn)表2)。血漿AngⅡ測(cè)量均在省立醫(yī)院檢驗(yàn)科采用放射免疫法統(tǒng)一測(cè)量。測(cè)得的患者24小時(shí)尿蛋白定量均在0.5g以上,血肌酐水平均在正常范圍內(nèi)(山東省立醫(yī)院質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為40-135μmol/L)。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)在各種系膜增殖性疾病中系膜細(xì)胞胞漿胞核人HuR蛋白的表達(dá)水平變化。(2)體外部分：a.配制濃度為100ng/ml的AngⅡ加入培養(yǎng)液中刺激人系膜細(xì)胞,分別觀察0小時(shí)、3小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)時(shí)所需指標(biāo)的水平變化。細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)HuR蛋白在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化；b. Westernb lot方法測(cè)定AngⅡ刺激HMC 0小時(shí)、3小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)時(shí)胞漿HuR水平,以及HuR干擾前后CyclinDl mRNA及蛋白表達(dá)水平；c.流式細(xì)胞儀檢測(cè)HuR干擾前后對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)HMC細(xì)胞周期的影響；d.放線菌素D法檢測(cè)AngⅡ刺激前后CyclinD1 mRNA穩(wěn)定性的變化；e.CCK-8檢測(cè)系膜細(xì)胞增殖水平；f.免疫沉淀法測(cè)定AngⅡ刺激前后HuR與CyclinDl mRNA結(jié)合水平。研究結(jié)果(1)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：正常人腎小球中有部分系膜細(xì)胞,細(xì)胞核中有少量HuR蛋白表達(dá)。而在糖尿病腎病,狼瘡性腎炎全部組織中,與正常組相比,HuR蛋白在細(xì)胞漿中的含量顯著增加。在系膜細(xì)胞輕度增殖的IgA腎病和紫癜性腎炎中,只有部分HuR蛋白在胞漿中表達(dá)增多。而在原發(fā)性膜性腎病患者系膜細(xì)胞中,HuR水平無(wú)顯著變化。(2)細(xì)胞免疫組化學(xué)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Ang刺激組可見(jiàn)HuR從胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì),其中在3小時(shí)和6小時(shí)變化胞漿中增加最為顯著,之后水平逐漸恢復(fù)；相應(yīng)的使用Westernblot方法觀察HuR蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)類(lèi)似的變化趨勢(shì),可見(jiàn)第3小時(shí)和第6小時(shí)細(xì)胞胞漿中HuR蛋白的表達(dá)增加,細(xì)胞核中一過(guò)性減少,而總蛋白水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)流式細(xì)胞儀分析經(jīng)AngⅡ刺激后G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均減少,S期百分?jǐn)?shù)增加,表明系膜細(xì)胞進(jìn)入增殖期。相應(yīng)地,RT-PCR及Westemblot結(jié)果顯示,AngⅡ誘導(dǎo)的CyclinD1 mRNA水平顯著增加(P0.05),蛋白水平明顯增高(P0.05)。免疫沉淀法顯示AngⅡ刺激后的HuR 與 CyclinD1 mRNA結(jié)合能力顯著升高(P0.05)。經(jīng)過(guò)AngⅡ刺激后的CyclinD1 mRNA穩(wěn)定性明顯延長(zhǎng),由正常的9.13小時(shí)升至20.34小時(shí)(P0.05)。(4)在系膜細(xì)胞中對(duì)HuRmRNA進(jìn)行沉默,qRT-PCR檢測(cè)siHuR干擾后CyclinD1mRNA水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是Westernblot結(jié)果顯示CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著下降(P0.05)。流式細(xì)胞儀分析顯示HuR干擾后G1期有所上升,S期和M期均有下降；免疫沉淀法顯示HuR干擾后HuR與CyclinDl mRNA結(jié)合能力顯著降低(P0.05)。HuR干擾后,CyclinD1 mRNA穩(wěn)定性有所下降,但未恢復(fù)正常水平,CCK-8檢測(cè)到其增殖數(shù)量相比于AngⅡ刺激組顯著減少。研究結(jié)論HuR與CyclinD1蛋白表達(dá)水平在病理性系膜細(xì)胞增殖發(fā)生時(shí)表達(dá)明顯增高,特別是在血管緊張素AngⅡ刺激時(shí)增殖現(xiàn)象明顯。具體表現(xiàn)為CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著增高,并且伴隨HuR蛋白從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿內(nèi)的一過(guò)性遷移性表現(xiàn)。在此過(guò)程中,我們推測(cè)是由于CyclinD1 mRNA的穩(wěn)定性顯著延長(zhǎng),導(dǎo)致其蛋白表達(dá)增多,從而造成系膜細(xì)胞的過(guò)度增生。而干擾HuR后CyclinD1 mRNA穩(wěn)定性顯著減少,蛋白水平下降,提示HuR可能通過(guò)降低CyclinD1轉(zhuǎn)錄后水平來(lái)影響腎臟細(xì)胞異常增殖的發(fā)生。如在此基礎(chǔ)上進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù),進(jìn)一步探討抑制HuR對(duì)慢性腎臟病是否具有保護(hù)效應(yīng),一方面有助于幫助我們深入理解慢性腎臟病發(fā)生的病理生理機(jī)制,同時(shí)為尋求更可行、有效和安全的干預(yù)手段進(jìn)行有意的嘗試。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：R692.9;R587.2
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號(hào)說(shuō)明
前言
第一部分
    背景
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
第二部分
    背景
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
第一部分 附圖
第二部分 附圖
附表
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文目錄
外文論文1
外文論文2
學(xué)位論文評(píng)閱及答辯巧況表

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