研究背景及目的:常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是最常見的遺傳性腎臟病,其在人群中的發(fā)病率約為1:400~1:1000。大多數患者于青年時期發(fā)病,主要病理改變?yōu)槟I小管進行性囊性擴張,壓迫正常的腎臟結構,破壞腎臟功能,最終導致終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)。約50%的ADPKD患者在60歲時進展至ESRD,只能依賴透析或者腎移植維持生命,給社會和家庭帶來了沉重的負擔。目前已經明確ADPKD的致病基因為突變的Pkd1和Pkd2基因(分別編碼多囊蛋白1和多囊蛋白2),其中,Pkd1基因突變占85%。盡管ADPKD的主要致病基因已經明確,然而由于Pkd1基因編碼序列過長,突變位點及突變方式變化多端,使得其臨床表現在不同遺傳家系之間存在巨大差異;然而隨著研究的深入,我們發(fā)現,盡管在同一個遺傳家系之內,乃至同卵雙胞胎之間,該疾病的進展與預后仍存在著很大差異,這提示我們,除了基因本身的突變之外,基因的轉錄及轉錄后調控等表觀遺傳學過程也會對該疾病的進程起到很大的影響作用。而基因的甲基化是一種非常重要的基因轉錄調控機制。因此,我們課題組對多囊腎病患者的腎臟標本進行了甲基化測序,發(fā)現Klotho蛋白啟動子區(qū)域存在基因甲基化水平升高,提示該蛋白在多囊腎病的發(fā)病進程中可能存在表達下調。Klotho蛋白(也作α-Klotho蛋白)是一種主要表達于遠端腎小管及大腦的Ⅰ型膜蛋白,由KL基因編碼。該蛋白由KL1和KL2兩個亞基組成,可以被去整合素和金屬蛋白酶(A desintegrin and metalloproteinase,ADAM)10和ADAM17切割為不同長度的片段并釋放進入血液、尿液及腦脊液中,成為一種內分泌、自分泌和旁分泌因子,同多種受體結合,作用于其他細胞,其中起到最主要作用的是可溶性全長Klotho蛋白。1997年,Kuro-o等人發(fā)現,Klotho基因5’端插入突變的小鼠會出現多種衰老相關體征,且壽命明顯縮短。研究發(fā)現,Klotho蛋白不僅調控衰老過程,還參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展,如腫瘤、二型糖尿病、心肌肥厚和慢性腎衰竭。目前已有相關臨床研究證實,ADPKD患者血清中Klotho蛋白水平降低,且與腎臟總體積負相關。除此之外,Klotho蛋白作為一種具有抑制炎性反應作用的因子,能夠調控TGF-β、Akt、Wnt和TNF-α等相關信號通路,而這些通路在常染色體多囊腎病的發(fā)病進程中均起到重要作用,因此探究Klotho蛋白在常染色體顯性多囊腎病囊腫發(fā)生及生長的過程中起到的作用具有重要意義。本研究擬探究Klotho蛋白在多囊腎病細胞系及組織中的表達情況,明確Pkd1突變對Klotho蛋白表達的影響,以及Klotho蛋白在ADPKD囊腫發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機制,為疾病的治療提供新的作用靶點。研究方法:(1)收集臨床ADPKD患者腎臟組織樣本及正常腎臟組織樣本,Pkd1條件敲除小鼠腎臟組織樣本及野生型小鼠腎臟樣本,Pkd1~(+/-)和Pkd~(-/-)腎臟上皮細胞系,利用蛋白免疫印跡、免疫組織化學和RT-PCR技術,檢測其中Klotho蛋白的表達情況。(2)建立晚期誘導PKD1~(fl/fl):tamoxifen-cre小鼠模型,模擬ADPKD發(fā)病真實情況,進一步觀察鼠重組Klotho蛋白對囊腫生成的調控作用。(3)通過蛋白免疫印跡檢測c-Myc,Cyclin D1,p-STAT3等蛋白水平,驗證Klotho對小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細胞增殖的調控作用。(4)通過對ADPKD患者腎臟組織及正常腎臟組織的基因甲基化測序,明確Klotho在ADPKD中表達下調的原因,并通過染色質免疫共沉淀技術,驗證DNMT1蛋白與Klotho啟動子區(qū)域結合情況;通過蛋白免疫印跡技術檢測DNMT1蛋白與Klotho蛋白的調控環(huán)路。(5)通過蛋白免疫印跡技術及RT-PCR技術,分別檢測Smyd2、p-P65、TNF-α、Ccl-2的表達水平,明確Klotho對小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細胞炎性反應的調控作用。(6)通過細胞流式技術檢測C11:BODIPY581/591在小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細胞染色的陽性率,蛋白免疫印跡技術及RT-PCR技術檢測GPX-4在小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細胞及小鼠腎臟中的表達情況,并進行細胞MTT實驗,明確Klotho對鐵死亡過程的影響作用;(7)通過小鼠腎臟組織Masson染色、α-SMA染色、Collagen-Ⅰ染色,以及小鼠腎臟組織蛋白免疫印跡技術檢測TGF-β、Fibronectin、α-SMA、p-smad2/3蛋白水平,明確Klotho對ADPKD中的纖維化過程的抑制作用;在大鼠成纖維細胞中驗證TGF-β對Klotho表達的抑制作用。結果:(1)Klotho蛋白在ADPKD患者腎臟組織、小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮及PKD1~(fl/fl):Pkhd1-cre小鼠腎臟組織中表達下調。(2)在晚期誘導PKD1~(fl/fl):tamoxifen-cre小鼠模型中,腹腔注射鼠重組Klotho蛋白能夠延緩ADPKD病情進展,改善腎功能,減緩腎臟體積增長速度。(3)鼠重組Klotho蛋白能夠下調小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細胞增殖相關通路蛋白水平,抑制細胞增殖。(4)ADPKD患者腎臟組織基因甲基化測序提示,Klotho基因在ADPKD腎臟中,啟動子及基因體區(qū)域高度甲基化。甲基化特別是啟動序列的甲基化會使基因沉默,表達下調。(5)染色質免疫共沉淀技術在小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細胞中發(fā)現,Klotho基因啟動子區(qū)域與DNMT1存在結合。(6)DNMT1抑制劑Hydralazin處理小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細胞能夠上調Klotho蛋白表達水平;同時,鼠重組Klotho蛋白能夠下調小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細胞及ADPKD小鼠腎臟組織中的DNMT1水平。(7)鼠重組Klotho蛋白能夠下調Smyd2及p-P65蛋白水平,抑制TNF-α和Ccl-2表達,從而抑制細胞及小鼠ADPKD腎臟組織的炎性反應。(8)鼠重組Klotho蛋白處理小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細胞后,以MTT檢測細胞活性,發(fā)現盡管Klotho蛋白能夠抑制多條細胞增殖相關通路,然而Klotho處理組存活細胞數量較對照組并無下降,甚至還有輕微升高趨勢,提示Klotho處理可能抑制某種細胞死亡過程。(9)鼠重組Klotho蛋白能夠上調小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細胞及小鼠ADPKD腎臟組織中GPX-4的表達水平,抑制鐵死亡發(fā)生。(10)流式細胞學檢測發(fā)現,鼠重組Klotho蛋白處理小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細胞后,C11:BODIPY581/591染色陽性細胞比例下降,提示Klotho能夠減輕細胞的脂質過氧化情況,從而抑制鐵死亡發(fā)生。(11)Masson染色、α-SMA染色及Collagen-Ⅰ染色提示,外源性補充Klotho蛋白能夠抑制ADPKD中的纖維化進程;同時,Klotho處理能夠下調ADPKD小鼠腎臟組織中的纖維化相關蛋白表達水平,進一步證實其對纖維化進程的抑制作用。(12)TGF-β處理大鼠成纖維細胞能夠抑制Klotho蛋白表達。結論:(1)Klotho蛋白在ADPKD囊腫發(fā)生發(fā)展中起到重要的調控作用;(2)DNMT1引起的Klotho基因啟動子區(qū)域甲基化水平升高,是導致Klotho蛋白在ADPKD中表達下調的主要原因;(3)Klotho蛋白能夠通過影響ADPKD發(fā)病過程中細胞的增殖、死亡、炎性反應及纖維化進程等方面,調控ADPKD病情進展。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：
p<0.001。實驗結果Klotho 蛋白在 Pkd1 敲除腎臟上皮細胞系中的白在正常的腎小管上皮中表達，為了初步驗證在 Pkd1 缺，我們選取了兩組 Pkd1 突變腎臟上皮細胞系，分別代表d1 突變的病理生理情況，并通過 RT-PCR 驗證 Klotho 基因，以及蛋白免疫印跡驗證 Klotho 蛋白的表達情況。lotho 蛋白在小鼠 Pkd1-/-和 Pkd1+/-腎小管上皮細胞驗通過 RT-PCR（圖 1-1A）驗證了相較 Pkd1+/-腎小管上皮胞系的 Klotho 基因在轉錄水平上明顯下調（t 檢驗，1.001 ±0.03802%，P=0.0016，t=7.668）；而后又通過蛋白免疫Klotho 蛋白水平在 Pkd1 突變的腎小管上皮中明顯下降（圖環(huán)境下，Pkd1 基因突變對 Klotho 蛋白表達的影響。
. Klotho 蛋白在小鼠胚腎 Pkd1 WT 和 Pkd1 null MEK 細胞系）Klotho 蛋白在 Pkd1fl/fl：Pkhd-cre 小鼠中的表kd1fl/fl：Pkhd-cre小鼠的繁育及基因鑒定型為 Pkd1fl/+：Pkhd-cre（+）的適應公鼠和母鼠合籠，待母鼠產鼠的出生日期，在小鼠出生第五天進行剪腳趾編號，并將剪下基因鑒定，見圖 1-3。其中，基因型為 F4R5(-/-)Cre(+)為 PKre（-）及 F4R5（+/+）Cre（+）的小鼠可作為野生型對照。
圖 1-2. Klotho 蛋白在小鼠胚腎 Pkd1 WT 和 Pkd1 null MEK 細胞系的表達（二）Klotho 蛋白在 Pkd1fl/fl：Pkhd-cre 小鼠中的表達1、 Pkd1fl/fl：Pkhd-cre小鼠的繁育及基因鑒定將基因型為 Pkd1fl/+：Pkhd-cre（+）的適應公鼠和母鼠合籠，待母鼠產下小鼠后，確記錄小鼠的出生日期，在小鼠出生第五天進行剪腳趾編號，并將剪下的腳趾及鼠組織進行基因鑒定，見圖 1-3。其中，基因型為 F4R5(-/-)Cre(+)為 PKD 發(fā)病小鼠，因型為 Cre（-）及 F4R5（+/+）Cre（+）的小鼠可作為野生型對照。
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本文編號：
2878062
