發(fā)布時(shí)間：2020-12-05 07:01

　　目的本研究探討晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）對(duì)腎小管上皮細(xì)胞（TECs）自噬-溶酶體系統(tǒng)的影響,及其是否通過(guò)與RAGE受體的相互作用引發(fā)氧化應(yīng)激而造成溶酶體損傷,為糖尿病腎病的治療提供新思路。方法AGE-BSA（100μg/ml）刺激HK-2細(xì)胞12h后,加用或不加用溶酶體抑制劑用蛋白免疫印跡和免疫熒光檢測(cè)LC3-II轉(zhuǎn)化,研究AGEs對(duì)腎小管上皮細(xì)胞自噬活性的影響;運(yùn)用免疫熒光共標(biāo)記觀察LAMP1和LC3-II共定位,檢測(cè)AGEs對(duì)腎小管上皮細(xì)胞自噬泡與溶酶體融合的影響。AGE-BSA（100μg/ml）刺激HK-2細(xì)胞6、12、24h后,運(yùn)用組織蛋白酶B（CB）、D、L試劑盒分別檢測(cè)AGEs對(duì)HK-2細(xì)胞溶酶體組織蛋白酶的活性;免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)觀察示蹤紅（TLR）熒光和DQ-卵清蛋白熒光,檢測(cè)AGEs對(duì)腎小管上皮細(xì)胞溶酶體酸化程度和溶酶體消化功能的影響;運(yùn)用免疫熒光共標(biāo)記觀察LAMP1和CB熒光,檢測(cè)AGEs對(duì)腎小管上皮細(xì)胞溶酶體完整性（溶酶體膜通透化LMP）的影響。AGE-BSA（100μg/ml）刺激HK-2細(xì)胞,免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)觀察阻斷AGEs與抗體結(jié)合或抗氧化劑預(yù)處理... 

【文章來(lái)源】：暨南大學(xué)廣東省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

自噬通路動(dòng)態(tài)流程示意圖（摘自：JohansenT,etal.Autophagy,2011;7(3):279-96.）

酶和溶酶體膜的共定位情況來(lái)評(píng)價(jià)溶酶體膜通透。未受刺激的HK-2細(xì)胞（0h）在顯示出規(guī)則的繞核分布的顆粒狀CB的紅色熒光，但是AGE-BSA分別刺激6h，12h，24h后，CB的光點(diǎn)變得分散而不規(guī)則，提示CB從溶酶體中漏出到了胞漿(圖3.3A,B)。進(jìn)一步來(lái)看CB從溶酶體中的漏出和溶酶體膜通透的關(guān)系，免疫熒光雙標(biāo)記溶酶體膜蛋白LAMP-1及溶酶體酶CB，對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)LAMP1光點(diǎn)規(guī)則繞核分布于胞漿中，而且大部分與CB熒光共定位。AGE-BSA刺激后溶酶體膜蛋白LAMP1在細(xì)胞內(nèi)分布不規(guī)則，聚集呈粗大成團(tuán)狀分布，組織蛋白酶CB和LAMP1沒(méi)有明顯的共定位，CB散布于LAMP1外，不管是用LAMP1變化還是CB變化所提示的發(fā)生LMP的細(xì)胞占總的HK-2細(xì)胞的百分比隨著AGE-BSA作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0.01（圖3.3A, B

45圖 4.1 抗 RAGE 抗體或抗氧化劑預(yù)處理對(duì) AGE-BSA 刺激后 HK-2 細(xì)胞溶酶體酸化程度的影響(A) 熒光顯微鏡觀察經(jīng)過(guò)抗 RAGE 抗體、NAC 或 catalase (CAT)預(yù)處理后，暴露于 Co-BSA或 AGE-BSA 的 HK-2 細(xì)胞示蹤紅熒光； (B)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示蹤紅熒光信號(hào)和平均熒光強(qiáng)度，細(xì)胞分組處理同（A） 注：比例尺，20 μm. *P < 0.05，**P < 0.01.


本文編號(hào)：2899077