發(fā)布時間：2018-02-24 20:27

  本文關(guān)鍵詞： 戊型肝炎病毒 開放讀碼框3 核因子-κB 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 由于人們在20世紀(jì)80年代之前尚沒有認(rèn)識到戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)的存在,故HEV被眾多學(xué)者稱為“被遺忘的病毒”。直到上世紀(jì)80年代,在蘇聯(lián)占領(lǐng)的阿富汗軍營中爆發(fā)了一種不明原因的肝炎,后來研究人員利用電鏡在志愿者的大便中發(fā)現(xiàn)了病毒顆粒,經(jīng)基因測序,于1991年正式命名為HEV。近年來,隨著醫(yī)學(xué)檢測手段的不斷提高以及人們對其認(rèn)識的不斷深入,HEV所引起的公共衛(wèi)生問題也逐漸成為科學(xué)界關(guān)注的焦點。先前認(rèn)為,HEV感染主要發(fā)生于基礎(chǔ)衛(wèi)生設(shè)施條件較差的發(fā)展中國家,但近年來,在歐美、日本等一些發(fā)達(dá)國家也出現(xiàn)了一些非輸入性本土化的HEV感染病例。目前,HEV感染呈全球分布,全世界每年約20億人感染HEV,約1400萬人為有癥狀者,每年約30萬人死于HEV感染,HEV感染占急性肝炎的50%以上,已成為全球急性病毒性肝炎的首要病因。自2012年開始至今,HEV在我國的感染及死亡總?cè)藬?shù)每年均超過甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為,HEV感染后為一自限性過程,但在普通人群中仍有1-2%的患者發(fā)展為重型肝炎而導(dǎo)致死亡,孕婦感染HEV后可導(dǎo)致高達(dá)26.9%的死亡率,近年來在器官移植、腫瘤放化療及HIV感染者等一些免疫功能受到抑制的人群中出現(xiàn)了為數(shù)不少的慢性化病例的報道。因此,戊肝的防控形勢不容樂觀。盡管我國在2012年上市了全球第一支HEV疫苗,但HEV致病的確切機(jī)制并未得以詳細(xì)的闡明。 HEV是一單股正鏈RNA病毒,全長約7.2kb,有3個開放讀碼框(ORF),4個基因型,1個血清型。其中,基因Ⅰ型和Ⅱ型主要感染人類,而Ⅲ型和Ⅳ型為人畜共患性疾�。晃覈�主要流行基因Ⅰ型和Ⅳ型。研究發(fā)現(xiàn),基因Ⅰ型HEV感染后相較其它基因型HEV感染具有更高的病毒血癥和更嚴(yán)重的病情,但機(jī)制不明。由于缺乏成熟的小動物研究模型和體外細(xì)胞模型,目前對HEV致病機(jī)制的研究大多集中于對其基因組功能的分析上。HEV的ORF1和ORF2分別編碼HEV的非結(jié)構(gòu)蛋白和衣殼蛋白,ORF3片段具體的功能目前尚沒有一致意見。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),HEV ORF3蛋白抑制TNF-a誘導(dǎo)的p65入核,我們推測,ORF3蛋白可能通過調(diào)控宿主細(xì)胞核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)信號為HEV復(fù)制優(yōu)化環(huán)境。本研究通過構(gòu)建HEV ORF3蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒,以人肺腺癌A549上皮細(xì)胞(A549)為載體,檢測HEV ORF3對細(xì)胞NF-κB信號的影響,從細(xì)胞水平進(jìn)一步探討HEV ORF3蛋白在TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號調(diào)節(jié)中的具體作用及機(jī)制,初步揭示HEV感染后細(xì)胞內(nèi)信號異常與HEV致病的相關(guān)性,為闡明HEV的致病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。 研究目的 在前期研究工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討基因Ⅰ型戊型肝炎病毒ORF3蛋白在TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及調(diào)控機(jī)制,闡明基因Ⅰ型HEV導(dǎo)致較高病毒血癥及較嚴(yán)重病程的具體機(jī)制。 實驗方法 1.根據(jù)已經(jīng)報道的巴基斯坦株Sar-55(基因Ⅰ型HEV)的cDNA序列中ORF3片段的序列,分別設(shè)計其上下游引物,采用PCR方法擴(kuò)增出HEV ORF3片段,利用限制性內(nèi)切酶將ORF3片段連接在真核表達(dá)載體pEGFP-N1上,構(gòu)建帶有綠色熒光的ORF3真核表達(dá)質(zhì)粒(ORF3-GFP),基因測序及酶切鑒定正確； 2.將鑒定正確的ORF3-GFP融合蛋白瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,48小時后,以TNF-a (50ng/ml)誘導(dǎo)NF-κB信號活化,通過蛋白印跡技術(shù)(Western blot)分別檢測細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)p65的表達(dá)水平,通過凝膠電泳遷移實驗(EMSA)檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性,分別以實時熒光定量PCR (real time PCR)和酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)檢測NF-κB下游分子的變化情況； 3.用Western blot檢測NF-κB經(jīng)典信號通路途徑中IKKβ的活性變化及IKBa的磷酸化水平的變化；以基因芯片技術(shù)(PCR Array)初步篩選ORF3-GFP作用于NF-κB信號通路中的關(guān)鍵分子,并以real time PCR和Western blot技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行驗證； 4.設(shè)計并合成上述PCR Array中發(fā)現(xiàn)的負(fù)性調(diào)控基因的三條特異的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA),進(jìn)行干擾效果的初步評估,采用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)干擾上述初篩的主要調(diào)控基因后,以熒光素酶報告基因活性檢測TNF-a誘導(dǎo)的NF-κB活性的變化； 5.通過Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和非折疊蛋白反應(yīng)的標(biāo)志蛋白,觀察A20分子表達(dá)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)性；給予非折疊蛋白反應(yīng)的阻滯劑對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,然后轉(zhuǎn)染ORF3-GFP,給予TNF-α干預(yù),以熒光素酶報告基因活性檢測NF-κB活性。 實驗結(jié)果 1.成功構(gòu)建了基因Ⅰ型HEV ORF3表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,48小時后,熒光顯微鏡下可以看到綠色熒光表達(dá),以HEV ORF3單克隆抗體行Western blot檢測,驗證了ORF3蛋白在A549細(xì)胞中成功表達(dá),將構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)基因測序及酶切鑒定正確； 2.Western blot顯示,在沒有TNF-α刺激時,p65主要位于細(xì)胞漿內(nèi),給予TNF-α刺激后,空白組及轉(zhuǎn)染空載體的A549細(xì)胞,p65出現(xiàn)了明顯的核轉(zhuǎn)移,而轉(zhuǎn)染了ORF3-GFP蛋白的細(xì)胞,給予TNF-α刺激后,細(xì)胞核內(nèi)p65的數(shù)量極少; 3.EMSA實驗表明,轉(zhuǎn)染GFP的細(xì)胞和未處理的細(xì)胞給予TNF-α刺激后,與陽性對照組一樣,出現(xiàn)了蛋白-DNA復(fù)合物,而表達(dá)ORF3-GFP蛋白的細(xì)胞組即使給予TNF-α刺激,也未見蛋白-DNA復(fù)合物的出現(xiàn),蛋白-DNA復(fù)合物在冷競爭實驗時消失,而進(jìn)行突變競爭實驗時,該復(fù)合物再次出現(xiàn); 4.Real time PCR示ORF3-GFP明顯抑制了TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的下游基因IL-1β、COX2和ICAM1的mRNA表達(dá)水平;ELISA證實NF-κB的下游分子IL-1β、 COX2、和ICAM1的蛋白水平也同樣受到了抑制； 5.Western blot顯示,空白細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞組給予TNF-a刺激后,IKKβ活性和IKBa的磷酸化水平明顯增強(qiáng),而轉(zhuǎn)染ORF3-GFP蛋白的細(xì)胞給予TNF-a刺激后, IKKβ活性和IKBa的磷酸化水平明顯受到抑制； 6.PCR Array實驗表明,轉(zhuǎn)染ORF3-GFP蛋白的細(xì)胞A20基因水平明顯高于對照組10倍以上,real time PCR和western blot也證實了同樣的結(jié)果; 7.將A20基因進(jìn)行RNAi后,ORF3-GFP蛋白抑制NF-κB活性的現(xiàn)象得到了逆轉(zhuǎn)；表達(dá)ORF3-GFP蛋白的細(xì)胞組A20的升高與GRP78呈正相關(guān)性,將非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)抑制后,ORF3-GFP抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活性的現(xiàn)象也得到了逆轉(zhuǎn)。 結(jié)論 1.基因Ⅰ型HEV ORF3蛋白抑制TNF-β誘導(dǎo)的NF-κB活性及其下游分子,提示這可能是基因Ⅰ型HEV在體內(nèi)持續(xù)存在并引起較高病毒血癥和更長病程的原因： 2.基因Ⅰ型HEV ORF3蛋白在早期可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR激活NF-κB信號,隨后,NF-κB下游的靶基因A20在NF-κB信號中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用,及時終止NF-κB信號的無限放大。這提示,ORF3蛋白在不同的階段對NF-κB信號的調(diào)控可能存在雙向調(diào)節(jié)作用。 3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與NF-κB信號之間有著密切聯(lián)系,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不僅可以激活NF-κB信號,在特定環(huán)境下,還可以對NF-κB信號發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.6

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本文編號：1531601