發(fā)布時(shí)間：2018-02-26 18:14

  本文關(guān)鍵詞： 肝纖維化長(zhǎng)鏈非編碼RNA 肝星形細(xì)胞 Smad2/3 TGFβ Notch　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA;lnc RNA)廣泛地參與基因表達(dá)調(diào)控,在發(fā)育、疾病的發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。然而,目前還沒(méi)有研究報(bào)道lnc RNA在肝纖維化發(fā)病過(guò)程中的作用。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建肝纖維化小鼠模型并利用基因芯片技術(shù)篩選纖維化肝組織中差異表達(dá)的lnc RNAs,從中確定一個(gè)差異顯著且肝組織特異性表達(dá)的lnc RNA。闡明其在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制及與肝纖維化發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系,為肝纖維化的診斷和治療提供新靶點(diǎn)。方法1.構(gòu)建四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型;通過(guò)對(duì)比模型鼠與正常對(duì)照鼠的肝臟外觀表型、肝組織的天狼猩紅染色、HE染色、羥脯氨酸含量測(cè)定、q RT-PCR、Western blot、免疫組織化學(xué)染色以及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)肝纖維化的各種指標(biāo)確證建模成功。2.應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選肝纖維化小鼠及正常小鼠肝組織中差異表達(dá)的lnc RNAs和m RNAs;并對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行差異分析、GO分析、KEGG Pathway分析、lnc RNA-m RNA共表達(dá)分析、臨近基因分析、同源性分析以及mi RNAs的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。3.根據(jù)差異分析和lnc RNA-m RNA共表達(dá)分析篩選出10個(gè)lnc RNAs,并在纖維化的肝組織、原代肝星形細(xì)胞、肝細(xì)胞、小鼠不同的器官組織中檢測(cè)它們的表達(dá)水平,確保芯片的可靠并篩選出一個(gè)肝特異性表達(dá),差異顯著的lnc RNA-Liver Fibrosis Associated lnc RNA1(lnc-LFAR1)。4.驗(yàn)證lnc-LFAR1不具有編碼功能;核漿分離提取RNA技術(shù)確定lnc-LFAR1在細(xì)胞中的定位;c DNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)技術(shù)測(cè)定lnc-LFAR1的全長(zhǎng)序列。5.以慢病毒為載體在分離的原代HSCs中過(guò)表達(dá)或敲低lnc-LFAR1的表達(dá)后,運(yùn)用q RT-PCR、Western blot和激光共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)與HSCs激活和纖維化發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)量改變。6.以慢病毒為載體在小鼠原代HCs及小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲低lnc-LFAR1的表達(dá)后,運(yùn)用q RT-PCR、Western blot和激光共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)與肝纖維化、細(xì)胞凋亡以及炎癥發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)量改變。7.構(gòu)建CCl4及膽管結(jié)扎(BDL)誘導(dǎo)肝纖維化小鼠模型,通過(guò)小鼠尾靜脈注射以慢病毒為載體的lnc-LFAR1干擾序列體內(nèi)確證lnc-LFAR1在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中的作用。8.通過(guò)RNA干擾技術(shù)、染色質(zhì)免疫沉淀(Ch IP)技術(shù)、熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)確證轉(zhuǎn)錄因子Smad2/3對(duì)lnc-LFAR1的調(diào)節(jié)作用。9.過(guò)表達(dá)或沉默lnc-LFAR1表達(dá)后,運(yùn)用q RT-PCR和Western blot技術(shù),檢測(cè)基因芯片結(jié)果中提示的與肝纖維化發(fā)病過(guò)程中密切關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路,例如TGFβ/Smad、Notch、MAPK1、NF-κB等信號(hào)通路的改變。10.運(yùn)用核酸結(jié)合蛋白免疫共沉淀(RIP)技術(shù)、Ch IP技術(shù)檢測(cè)lnc-LFAR1是否與轉(zhuǎn)錄因子Smad2/3或染色質(zhì)重塑復(fù)合物組分結(jié)合。結(jié)果1.通過(guò)基因芯片技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)全新的、尚未報(bào)道過(guò)的lnc RNA分子lnc-LFAR1。研究表明lnc-LFAR1是一個(gè)肝特異性表達(dá)的lnc RNA;在肝星形細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)lnc-LFAR1也均有表達(dá);盡管lnc-LFAR1在纖維化的肝組織中表達(dá)量減低;然而,在小鼠原代肝星形細(xì)胞培養(yǎng)激活過(guò)程中l(wèi)nc-LFAR1表達(dá)明顯增多;TGFβ刺激小鼠原代肝星形細(xì)胞(HSCs)和肝細(xì)胞(HCs)后lnc-LFAR1表達(dá)明顯增多;與正常的小鼠原代肝星形細(xì)胞相比,肝纖維化小鼠的原代肝星形細(xì)胞(HSCs)內(nèi)lnc-LFAR1表達(dá)也顯著增多。2.研究發(fā)現(xiàn),lnc-LFAR1促進(jìn)HSCs的激活;促進(jìn)促肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。3.在原代HCs和小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞中,敲低lnc-LFAR1的表達(dá)抑制TGFβ引起的促肝纖維化相關(guān)基因、促炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平的增高;敲低lnc-LFAR1的表達(dá)同時(shí)抑制TGFβ引起HCs凋亡。4.敲低lnc-LFAR1的表達(dá)抑制CCl4及膽管結(jié)扎(BDL)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的發(fā)生。5.TGFβ通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Smad2/3結(jié)合于lnc-LFAR1的啟動(dòng)子區(qū)域,從而促進(jìn)lnc-LFAR1的表達(dá)。6.Lnc-LFAR1通過(guò)促進(jìn)Smad2/3的磷酸化以及轉(zhuǎn)錄,激活TGFβ-Smad2/3信號(hào)通路。7.Lnc-LFAR1通過(guò)促進(jìn)Notch2、Notch3和Hes1的轉(zhuǎn)錄,從而激活Notch信號(hào)通路。8.細(xì)胞漿內(nèi)的lnc-LFAR1通過(guò)促進(jìn)TGFβR1與Smad2/3的結(jié)合,從而促進(jìn)Smad2/3的磷酸化。9.細(xì)胞核內(nèi)的lnc-LFAR1與轉(zhuǎn)錄因子Smad2/3結(jié)合,促進(jìn)TGFβ-Smad2/3信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路組分的基因轉(zhuǎn)錄,從而激活TGFβ和Notch信號(hào)通路。結(jié)論綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)肝特異性表達(dá)的lnc RNA分子lnc-LFAR1。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明lnc-LFAR1通過(guò)促進(jìn)HSCs的激活和HCs的凋亡,從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。機(jī)制上,細(xì)胞漿內(nèi)的lnc-LFAR1通過(guò)促進(jìn)TGFβR1與Smad2/3的結(jié)合,從而促進(jìn)Smad2/3的磷酸化。而細(xì)胞核內(nèi)的lnc-LFAR1與Smad2/3結(jié)合后促進(jìn)Smad2/3結(jié)合于α-SMA,Col1α1,MMP2,TGF-β,Smad2,Smad3,Notch2和Notch3的啟動(dòng)子區(qū)域,從而促進(jìn)這些靶基因的轉(zhuǎn)錄,激活TGFβ和Notch信號(hào)通路。通過(guò)深入探討lnc-LFAR1在肝纖維化發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的重要作用,豐富了lnc RNAs的分子作用機(jī)制;同時(shí)也完善了lnc RNAs的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為肝纖維化的診斷和治療提供新靶點(diǎn)。
[Abstract]:In recent years , it has been found that long noncoding RNA ( lnc RNA ) plays an important role in the pathogenesis of liver fibrosis . In this study , the expression of lnc - LFAR1 in liver fibrosis was significantly increased by using the technique of RNA interference and Western blot . The expression of lnc - LF1 mRNA in liver fibrosis mice was significantly increased by using the technique of RNA interference and Western blot . MMP2 , TGF - 尾 , Smad2 , Smad3 , Notch2 and Notch3 promote the transcription and activation of TGF - 尾 and Notch signaling pathways .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575.2

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本文編號(hào)：1539087