發(fā)布時間：2018-12-24 13:13

【摘要】：非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除酒精以及其他明確損肝因素所致的肝細胞內(nèi)甘油三酯過度沉積(5%的肝細胞組織)為主要特征的一種臨床病理綜合征。NAFLD不僅與2型糖尿病、肥胖有關,也是非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化甚至肝癌發(fā)展的風險因素之一。近年來其發(fā)病率逐年增高,已經(jīng)成為一個全球性的公共健康問題。目前治療藥物主要是針對改善胰島素抵抗和抗氧化應激等,存在療效不確切或藥物副作用大等因素,尚無治療NAFLD的特效藥物問世。近年來,納米和核酸適配體技術在載藥及藥物的靶向性研究中得到了越來越多的應用,是當前生物醫(yī)學領域的研究熱點。本文針對當前NAFLD治療的一些難題以及治療前景,通過多學科交叉,設計并構建了基于金納米粒子和核酸適配體的載藥載體,探索新型納米載藥載體在NAFLD治療中的應用,為將來NAFLD進行靶向藥物治療提供新的思路。鑒于課題的設計,本論文共分為三個部分。 第一部分：NAFLD細胞模型的構建、核酸適配體篩選及其特性分析 目的：本部分擬建立NAFLD細胞模型,采用細胞指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進化技術(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment,Cell-SELEX)針對NAFLD細胞進行篩選,獲得能特異性識別NAFLD細胞表面膜蛋白結構的核酸適配體,分析篩選到的核酸適配體NFD-1的相關特征,包括不同溫度下的特異性、親和性以及膜蛋白結合性。 方法：使用100uM油酸和50uM棕櫚酸誘導分化HepG2細胞1周構建NAFLD細胞模型；設計并合成隨機DNA文庫序列,中間25bp為隨機序列,兩端各有一段長16bp的引物序列,分別用異硫氰酸熒光素和生物素標記兩端引物。將NAFLD細胞作為正細胞,HepG2細胞作為負細胞,將DNA文庫與正負細胞反復孵育進行篩選,與正細胞結合而不與負細胞結合的文庫序列采用聚合酶鏈法(PCR)擴增并用作下一輪篩選及鑒定。每3-4輪篩選就使用流式細胞技術對文庫的富集程度進行監(jiān)測、鑒定。最后采用454測序方法對富集到的文庫進行測序,合成相關序列并通過流式細胞術進行鑒定；在4。C和37。C條件下將核酸適配體NFD-1與不同組織來源的細胞株孵育,流式細胞術測定其特異性,將NFD-1稀釋成不同濃度后與NAFLD細胞孵育,計算其解離常數(shù)；使用Trypsin和Proteinase K兩種蛋白酶檢測NFD-1靶標為膜蛋白。 結果：本實驗成功誘導分化建立了NAFLD細胞模型。應用Cell-SELEX技術對NAFLD細胞展開篩選,經(jīng)過24輪正負篩選后成功富集到針對NAFLD細胞的ssDNA文庫,經(jīng)過測序分析找到了4條核酸適配體與NAFLD細胞有結合,而與HepG2細胞不結合,我們選用結合能力強的1條核酸適配體進行實驗,并命名為NFD-1;在4。C和37。C條件下,核酸適配體NFD-1均能與NAFLD細胞特異性結合,而與其它組織來源的細胞株幾乎沒有結合。解離常數(shù)測定Kd值為21.5士5.6nM,提示NFD-1能與NAFLD細胞高親和力結合。蛋白酶檢測證實NFD-1的靶標為膜蛋白。 結論：通過Cell-SELEX技術針對NAFLD細胞進行篩選,獲得了1條在4。C和37。C條件下能與靶細胞膜蛋白高親和力、高特異性結合的核酸適配體NFD-1。 第二部分：金納米粒子載藥載體的構建 目的：合成并構建金納米粒子載藥載體,檢測其特異性。 方法：化學合成直徑為13nm的金納米粒子,將NFD-1和載藥GC序列修飾金納米粒子構建載藥載體,檢測其與NAFLD細胞結合的特異性。 結果：我們合成了直徑為13nm的金納米粒子,并成功修飾了NFD-1和載藥GC序列,檢測結果表明修飾了NFD-1的金納米粒子能特異性結合NAFLD細胞。 結論： NFD-1與載藥GC序列修飾的金納米粒子顯示出良好的結合特異性。 第三部分：修飾阿霉素并檢測修飾了NFD-1和Dox的金納米載藥載體的靶向載藥運輸 目的：將阿霉素(Doxycycline,Dox)修飾到金納米載藥載體并檢測Dox的效率；檢測修飾了核酸適配體NFD-1和Dox的的金納米載藥載體能否特異性進入NAFLD細胞。 方法：共聚焦顯微鏡檢測修飾了核酸適配體NFD-1和Dox的金納米載藥載體特異性進入NAFLD細胞。 結果：修飾了載藥GC序列的金納米載藥載體能結合300倍Dox的劑量,共聚焦顯微鏡顯示修飾了NFD-1和Dox的的金納米載藥載體能特異性地進入NAFLD細胞。 結論：修飾了核酸適配體NFD-1和Dox的金納米載藥載體能特異性地進入NAFLD細胞。
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【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575.5

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本文編號：2390668