發(fā)布時(shí)間：2018-12-24 13:13

【摘要】：非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除酒精以及其他明確損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯過(guò)度沉積(5%的肝細(xì)胞組織)為主要特征的一種臨床病理綜合征。NAFLD不僅與2型糖尿病、肥胖有關(guān),也是非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化甚至肝癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。近年來(lái)其發(fā)病率逐年增高,已經(jīng)成為一個(gè)全球性的公共健康問(wèn)題。目前治療藥物主要是針對(duì)改善胰島素抵抗和抗氧化應(yīng)激等,存在療效不確切或藥物副作用大等因素,尚無(wú)治療NAFLD的特效藥物問(wèn)世。近年來(lái),納米和核酸適配體技術(shù)在載藥及藥物的靶向性研究中得到了越來(lái)越多的應(yīng)用,是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文針對(duì)當(dāng)前NAFLD治療的一些難題以及治療前景,通過(guò)多學(xué)科交叉,設(shè)計(jì)并構(gòu)建了基于金納米粒子和核酸適配體的載藥載體,探索新型納米載藥載體在NAFLD治療中的應(yīng)用,為將來(lái)NAFLD進(jìn)行靶向藥物治療提供新的思路。鑒于課題的設(shè)計(jì),本論文共分為三個(gè)部分。 第一部分：NAFLD細(xì)胞模型的構(gòu)建、核酸適配體篩選及其特性分析 目的：本部分?jǐn)M建立NAFLD細(xì)胞模型,采用細(xì)胞指數(shù)級(jí)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment,Cell-SELEX)針對(duì)NAFLD細(xì)胞進(jìn)行篩選,獲得能特異性識(shí)別NAFLD細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)構(gòu)的核酸適配體,分析篩選到的核酸適配體NFD-1的相關(guān)特征,包括不同溫度下的特異性、親和性以及膜蛋白結(jié)合性。 方法：使用100uM油酸和50uM棕櫚酸誘導(dǎo)分化HepG2細(xì)胞1周構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型；設(shè)計(jì)并合成隨機(jī)DNA文庫(kù)序列,中間25bp為隨機(jī)序列,兩端各有一段長(zhǎng)16bp的引物序列,分別用異硫氰酸熒光素和生物素標(biāo)記兩端引物。將NAFLD細(xì)胞作為正細(xì)胞,HepG2細(xì)胞作為負(fù)細(xì)胞,將DNA文庫(kù)與正負(fù)細(xì)胞反復(fù)孵育進(jìn)行篩選,與正細(xì)胞結(jié)合而不與負(fù)細(xì)胞結(jié)合的文庫(kù)序列采用聚合酶鏈法(PCR)擴(kuò)增并用作下一輪篩選及鑒定。每3-4輪篩選就使用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)文庫(kù)的富集程度進(jìn)行監(jiān)測(cè)、鑒定。最后采用454測(cè)序方法對(duì)富集到的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,合成相關(guān)序列并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定；在4。C和37。C條件下將核酸適配體NFD-1與不同組織來(lái)源的細(xì)胞株孵育,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其特異性,將NFD-1稀釋成不同濃度后與NAFLD細(xì)胞孵育,計(jì)算其解離常數(shù)；使用Trypsin和Proteinase K兩種蛋白酶檢測(cè)NFD-1靶標(biāo)為膜蛋白。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)成功誘導(dǎo)分化建立了NAFLD細(xì)胞模型。應(yīng)用Cell-SELEX技術(shù)對(duì)NAFLD細(xì)胞展開篩選,經(jīng)過(guò)24輪正負(fù)篩選后成功富集到針對(duì)NAFLD細(xì)胞的ssDNA文庫(kù),經(jīng)過(guò)測(cè)序分析找到了4條核酸適配體與NAFLD細(xì)胞有結(jié)合,而與HepG2細(xì)胞不結(jié)合,我們選用結(jié)合能力強(qiáng)的1條核酸適配體進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并命名為NFD-1;在4。C和37。C條件下,核酸適配體NFD-1均能與NAFLD細(xì)胞特異性結(jié)合,而與其它組織來(lái)源的細(xì)胞株幾乎沒(méi)有結(jié)合。解離常數(shù)測(cè)定Kd值為21.5士5.6nM,提示NFD-1能與NAFLD細(xì)胞高親和力結(jié)合。蛋白酶檢測(cè)證實(shí)NFD-1的靶標(biāo)為膜蛋白。 結(jié)論：通過(guò)Cell-SELEX技術(shù)針對(duì)NAFLD細(xì)胞進(jìn)行篩選,獲得了1條在4。C和37。C條件下能與靶細(xì)胞膜蛋白高親和力、高特異性結(jié)合的核酸適配體NFD-1。 第二部分：金納米粒子載藥載體的構(gòu)建 目的：合成并構(gòu)建金納米粒子載藥載體,檢測(cè)其特異性。 方法：化學(xué)合成直徑為13nm的金納米粒子,將NFD-1和載藥GC序列修飾金納米粒子構(gòu)建載藥載體,檢測(cè)其與NAFLD細(xì)胞結(jié)合的特異性。 結(jié)果：我們合成了直徑為13nm的金納米粒子,并成功修飾了NFD-1和載藥GC序列,檢測(cè)結(jié)果表明修飾了NFD-1的金納米粒子能特異性結(jié)合NAFLD細(xì)胞。 結(jié)論： NFD-1與載藥GC序列修飾的金納米粒子顯示出良好的結(jié)合特異性。 第三部分：修飾阿霉素并檢測(cè)修飾了NFD-1和Dox的金納米載藥載體的靶向載藥運(yùn)輸 目的：將阿霉素(Doxycycline,Dox)修飾到金納米載藥載體并檢測(cè)Dox的效率；檢測(cè)修飾了核酸適配體NFD-1和Dox的的金納米載藥載體能否特異性進(jìn)入NAFLD細(xì)胞。 方法：共聚焦顯微鏡檢測(cè)修飾了核酸適配體NFD-1和Dox的金納米載藥載體特異性進(jìn)入NAFLD細(xì)胞。 結(jié)果：修飾了載藥GC序列的金納米載藥載體能結(jié)合300倍Dox的劑量,共聚焦顯微鏡顯示修飾了NFD-1和Dox的的金納米載藥載體能特異性地進(jìn)入NAFLD細(xì)胞。 結(jié)論：修飾了核酸適配體NFD-1和Dox的金納米載藥載體能特異性地進(jìn)入NAFLD細(xì)胞。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575.5

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本文編號(hào)：2390668