發(fā)布時(shí)間：2020-11-02 11:36

　　 目的:細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDKS)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員,能夠通過(guò)調(diào)節(jié)G/S以及G2/M期而影響整個(gè)細(xì)胞周期進(jìn)程。CDK2作為CDKS的催化亞基,對(duì)主要負(fù)責(zé)有絲分裂以及DNA復(fù)制的G1-S期的調(diào)控作用較強(qiáng),多種癌癥中均發(fā)現(xiàn)CDK2的異常表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂的情況�，F(xiàn)階段已經(jīng)研究出很多抗腫瘤CDK2抑制劑,但是僅有少數(shù)的幾個(gè)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)擬建立一種合理的虛擬篩選方案,篩選出具有新型母核結(jié)構(gòu),抗腫瘤活性強(qiáng)的CDK2抑制劑。方法:通過(guò)建立基于配體以及基于結(jié)構(gòu)相結(jié)合的多層虛擬篩選方法來(lái)篩選出具有對(duì)CDK2蛋白有抑制活性的苗頭化合物,再通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)以及MM/PBSA自由能計(jì)算選擇其中對(duì)蛋白結(jié)合最穩(wěn)定,親和力最強(qiáng)的先導(dǎo)化合物。多層虛擬篩選方法主要建立并優(yōu)化三個(gè)模型:支持向量機(jī)(SVM),蛋白配體指紋圖譜(PLIF)藥效團(tuán)以及分子對(duì)接。分子動(dòng)力學(xué)主要包括RMSD結(jié)合穩(wěn)定性分析,最后通過(guò)計(jì)算范德華能,靜電能,極性溶劑化以及非極性溶劑化能來(lái)計(jì)算MM/PBSA結(jié)合自由能。結(jié)果:1、使用LibSVM建立的SVM模型再進(jìn)行參數(shù)和描述符優(yōu)化:在C=32,γ=0.125使用遺傳算法優(yōu)選的最佳描述符時(shí),訓(xùn)練集和測(cè)試集的預(yù)測(cè)的總體準(zhǔn)確率最好,分別為99.79%以及92.72%。2、PLIF方法顯示了氨基酸殘基Glu81以及Leu83與大部分配體生成相互作用,并據(jù)此生成了5個(gè)藥效團(tuán),其中藥效團(tuán)3對(duì)訓(xùn)練集的產(chǎn)率以及命中率為89.6%以及12.5%,對(duì)測(cè)試集總體準(zhǔn)確率為94.32%,因此被選中用于建立多層虛擬篩選法。3、NDCG的計(jì)算結(jié)果表明:GOLD對(duì)接中的Chemscore打分函數(shù)能夠真實(shí)的反應(yīng)CDK2與配體結(jié)合的真實(shí)情況,將Chemscore打分閾值設(shè)置成-7的時(shí)候,在該打分函數(shù)下能夠?qū)�測(cè)試集擁有較低的假陽(yáng)性率和較高的總體準(zhǔn)確率。4、將建立的虛擬篩選模型對(duì)驗(yàn)證集375個(gè)抑制劑,155528個(gè)陰性化合物)進(jìn)行測(cè)試,命中率為80.1%,富集因子為332.83,產(chǎn)率為73.8%,最終耗時(shí)為1.62 h,說(shuō)明此多層虛擬篩選模型能夠準(zhǔn)確有效的在化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選CDK2抑制劑。5、使用此模型從BindingDB,Pubchem以及NCI數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到了6個(gè)苗頭化合物,在進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)以及MM/PBSA自由能計(jì)算后,最終確定了2個(gè)與CDK2親和力強(qiáng),結(jié)合穩(wěn)定并具有新型母核結(jié)構(gòu)的化合物。結(jié)論:1、多層虛擬篩選方法由于將基于配體以及基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選方法結(jié)合到一起,而同時(shí)考慮并利用到了受體和配體的信息,使其在篩選的效率和準(zhǔn)確度上相比任何一個(gè)方法單獨(dú)使用有了很大的提高。2、最終篩選得到的兩個(gè)先導(dǎo)化合物MM/PBSA結(jié)合能計(jì)算結(jié)果和分子動(dòng)力學(xué)結(jié)果與CDK2抑制劑Milciclib相似,說(shuō)明這兩個(gè)化合物與Milciclib有著相似的結(jié)合模式,穩(wěn)定性以及親和能力。3、本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明建立的多層虛擬篩選法能夠用來(lái)篩選CDK2抑制劑,篩選得到的化合物具有新型母核以及對(duì)CDK2蛋白具有高度的結(jié)合穩(wěn)定性以及親和力,進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該母核作為CDK2抑制劑具有很大的意義。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R96
【部分圖文】：

中的抑制劑分別與 Ile10, Gly13, Val18, Lys33, Glu81, Phe82, Leu83, Gln85, Asp86,Lys89, Gln131 以及 Asp145 形成了各種相互作用。其中氨基酸殘基 Leu83 的二維條碼是最密集的，大多數(shù) CDK2 抑制劑均與 Leu83 形成相互作用，Glu81, Lys33Asp86 等氨基酸業(yè)余大部分 CDK2 抑制劑的基團(tuán)形成了很多重要的相互作用。每一組指紋均用一個(gè)字母表示其含義（-: 沒(méi)有形成作用 D: 側(cè)鏈氫鍵供體, A: 側(cè)鏈氫鍵受體, d: 骨架氫鍵供體, a:骨架氫鍵受體, O: 溶劑氫鍵, I:離子相互作用, C:表面接觸, 當(dāng)一個(gè)相互作用用了兩個(gè)條碼表示時(shí)，左邊的表示弱相互作用，右邊的表示強(qiáng)相互作用）。大多數(shù)化合物對(duì) Leu83 和 Glu81 表現(xiàn)出強(qiáng)氫鍵相互作用，而對(duì) Asp83 殘基形成的相互作用類(lèi)型最多，包括側(cè)鏈氫鍵供體、骨架氫鍵受體、離子相互作用以及表面接觸。基于指紋圖譜，最終生成了 4 個(gè)藥效團(tuán)，使用訓(xùn)練集中的化合物對(duì)四種藥效團(tuán)的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果如表 3 所示。3 號(hào)藥效團(tuán)成功預(yù)測(cè)了測(cè)試集中 267 個(gè)陽(yáng)性化合物，擁有最高的產(chǎn)率 89.6%以及命中率12.5%。藥效團(tuán)模型雖然有區(qū)分陽(yáng)性化合物以及陰性化合物的能力，但是也同時(shí)伴隨著較高的假陽(yáng)性率，所以擬采用多層虛擬篩選法來(lái)解決藥效團(tuán)模型的缺點(diǎn)。

圖 2 A:指紋圖譜法生成的三號(hào)藥效團(tuán)，青色和紫色分別代表氫鍵供體和受體;B:藥效團(tuán)與疊加結(jié)構(gòu)的匹配表明，該藥效團(tuán)能較好地描述 66 種 CDK2 抑制劑取代基的疊加特征表 4 對(duì)生成的四種藥效團(tuán)進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證Pharmacophore models TP FP Yield (%) Hit rate (%)1 153 3740 51.3 4.092 235 2411 79.1 9.743 267 2127 89.6 12.54 227 3561 76.4 6.373.3 分子對(duì)接參數(shù)的確定以及驗(yàn)證分子對(duì)接中對(duì)接參數(shù)的優(yōu)化以及打分函數(shù)的選擇被認(rèn)為是整個(gè)過(guò)程中對(duì)對(duì)接結(jié)果影響最大的步驟。PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中與 4-氨基-（2,6-二氟苯基）-2-【（4-磺胺基苯基）氨基】-1,3-噻唑-5-羧酰胺結(jié)合的 CDK2 蛋白復(fù)合物（PDB ID:3R9H），相

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文化合物分為 10 組。每組選取一個(gè)具有代表性的化合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證配體與受體的結(jié)合親和力，根據(jù)與重要氨基酸（Ile10，Gly13，Val18，Lys33，Glu81，Phe82，Leu83，Gln85，Asp86，Lys89，Gln131，Asp145）相互作用的數(shù)量和合成難易度。最后，選擇 6 個(gè)具有代表性的新型骨架的化合物進(jìn)行進(jìn)一步的分子動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)（如圖 3 所示）。
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