發(fā)布時間：2020-11-10 00:53

　　 目的:近年來,基因治療的發(fā)展非常迅速。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是基因治療中最重要的發(fā)現(xiàn)之一,在治療腫瘤和病毒感染方面具有很大的使用潛力,得到了人們的廣泛關(guān)注。但是RNAi本身的一些理化性質(zhì)限制了小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)的應(yīng)用,穩(wěn)定性較差,易被生物體內(nèi)的核酸酶降解,降低了siRNA的應(yīng)用效率;并且siRNA分子量較大,具有親水性和負(fù)電性,這些都影響了siRNA的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效果。因此,如何能夠?qū)�siRNA成功地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中并發(fā)揮治療效果成為人們研究的熱點(diǎn)。在siRNA的應(yīng)用研究中,一個重要的目的就是能夠使siRNA成功穿透細(xì)胞膜,進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮療效。因此,細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)引起了人們的關(guān)注。細(xì)胞穿膜肽是由5-30個氨基酸按照一定的順序組成的兩性或陽性的短肽鏈。它能夠高效地穿過細(xì)胞膜,且能夠介導(dǎo)其它生物大分子(比如siRNA)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中,是目前研究較熱的藥物載體。本研究選用了具有類似穿膜肽性質(zhì)的八聚組氨酸(H8),它是由8個組氨酸分子反應(yīng)生成的一種陽性短肽,為了提高H8的穿膜效率,將H8與疏水基團(tuán)(硬脂酸,SA)反應(yīng),合成SA-H8和SA-H8-PEG2000兩種陽性載體,將合成的載體通過靜電作用與siRNA結(jié)合,組成SA-H8-PEG2000/siRNA和SA-H8-PEG2000n/siRNA納米復(fù)合物。通過測定納米復(fù)合物的電位、粒徑、凝膠阻滯能力考察SA-H8-PEG2000/siRNA和SA-H8-PEG2000n/siRNA的理化性質(zhì),篩選出了SA-H8-PEG2000/siRNA和SA-H8-PEG2000n/siRNA的最佳處方配比。以MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞為模型,考察載體與細(xì)胞之間的相互作用,評價細(xì)胞對載體藥物的攝取效率。方法:通過查閱文獻(xiàn)和試驗探索,確定了SA-H8和SA-H8-PEG2000兩種陽性載體材料的合成和純化方法。將sa和h8在室溫條件下攪拌反應(yīng)1h,用純凈水進(jìn)行透析純化,直接凍干備用,即得目的產(chǎn)物sa-h8。將sa-h8與mpeg2000-mal溶液混合,避光反應(yīng)48h,用純凈水透析純化,即得產(chǎn)物sa-h8-peg2000。以制劑的粒徑、電位和瓊脂糖凝膠電泳行為為指標(biāo),考察制劑的理化性質(zhì),篩選出最佳處方配比。選擇mcf-7細(xì)胞和a549細(xì)胞為細(xì)胞模型,以流式細(xì)胞分析的方法測定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,通過熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱來判定細(xì)胞的攝取效率,以評價載體對sirna的轉(zhuǎn)染效率的貢獻(xiàn)。結(jié)果:將合成的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果顯示合成得到sa-h8和sa-h8-peg2000兩種共軛物。以sirna作為模型效應(yīng)分子,通過室溫渦旋孵育的方法得到sa-h8-peg200020%/sirna、sa-h8-peg200050%/sirna和sa-h8-peg2000/sirna納米復(fù)合物。通過測定電位、粒徑以及凝膠阻滯試驗得到了納米復(fù)合物的理化性質(zhì)。sa-h8-peg200020%/sirna處方粒徑在200nm-700nm之間,且隨著n/p比的增加而變大。從瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果可以分析得到,當(dāng)n/p比為80時,仍然能夠看到清晰的條帶,說明sirna未被完全包載,sa-h8-peg200020%對sirna的包載能力較差。sa-h8-peg2000的比例提高至50%之后,sa-h8-peg200050%/sirna處方粒徑在350nm-450nm之間。n/p比為80時,sirna被完全包載。sa-h8-peg2000/sirna處方粒徑在300nm-400nm之間,且粒度分布相對均勻,當(dāng)n/p比大于或等于40時,實現(xiàn)sirna的完全包載。綜上所述,選擇sa-h8-peg200050%/sirna80:1和sa-h8-peg2000/sirna80:1作為最終處方。由流式細(xì)胞分析的結(jié)果可知:在a549與mcf-7細(xì)胞中,sa-h8-peg200050%/sirna和sa-h8-peg2000/sirna的細(xì)胞攝取率都隨著時間的推移而增大,呈現(xiàn)明顯的時間依賴性。sa-h8-peg200050%/sirna和sa-h8-peg2000/sirna兩種載體形式的細(xì)胞攝取率明顯高于游離sirna,但與市售制劑仍存在一定差距。結(jié)論:本研究所構(gòu)建的載體可以有效包載siRNA并顯著提高其細(xì)胞攝取水平。然而,為達(dá)到市售制劑的轉(zhuǎn)染能力,仍有必要對載體的處方、制備工藝進(jìn)一步優(yōu)化和篩選。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R943
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮寫
引言
第一部分 八聚組氨酸載體材料的合成
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    附圖
    討論
    小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第二部分 載核酸藥物納米復(fù)合物的制備以及表征
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    附圖
    附表
    討論
    小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第三部分 納米復(fù)合物與細(xì)胞間的相互作用
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    附圖
    附表
    討論
    小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
結(jié)論
綜述 脂質(zhì)多聚復(fù)合物作為非病毒性基因載體的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡歷

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本文編號：2877213