研究背景和目的細胞色素P450s(cytochrome P450 enzymes,CYPs)是人體重要的藥物代謝酶,主要分布在肝臟、小腸和腎臟,其藥物代謝量占人體總藥物代謝量的75%以上。CYPs的基礎(chǔ)表達和酶活性呈現(xiàn)明顯的個體差異,可導(dǎo)致藥物代謝以及清除速率的個體間差異,顯著影響臨床用藥的安全性及有效性。健康與疾病的發(fā)育起源學(xué)說(Developmental Origins of Health and Disease,DOHaD)源于20世紀90年代,該學(xué)說認為個體發(fā)育關(guān)鍵時期(宮內(nèi)發(fā)育階段、新生兒期和兒童期)對營養(yǎng)物質(zhì)、有毒化學(xué)物質(zhì)、藥物、感染等環(huán)境因素高度敏感,以至于改變對機體生理功能非常重要的基因表達,進而導(dǎo)致成年后對慢性疾病易感及藥物代謝能力的長期改變。過去40年中許多重大疾病和功能障礙疾病發(fā)生率大幅增加,其部分原因可能與發(fā)育早期暴露營養(yǎng)不均衡、有毒化學(xué)物質(zhì)、炎癥等環(huán)境因素有關(guān)。母體感染與炎癥是孕期常見的一種并發(fā)癥,會對兒童發(fā)育和健康產(chǎn)生很大影響。已有研究報道炎癥狀態(tài)可下調(diào)大多數(shù)藥物代謝酶(drug-metabolizing enzymes,DMEs)的表達。有研究發(fā)現(xiàn)小鼠孕期暴露脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可下調(diào)胎盤和胎鼠肝臟中Cyp3a11 mRNA和蛋白表達水平,然而孕期暴露LPS對子代鼠肝臟Cyp3a11及其它藥物代謝酶基因表達的長期影響仍未見報道。孕烷X受體(pregnane X receptor,Pxr)是肝臟中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,可調(diào)控肝藥物代謝酶的基礎(chǔ)表達及介導(dǎo)由外源物引起的CYPs同工酶的誘導(dǎo)表達。轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是炎癥反應(yīng)期間重要的調(diào)節(jié)因子。炎癥刺激可以通過將NF-κB p65亞基與類視黃醇X受體(retinoid X receptor,RXR)結(jié)合來調(diào)節(jié)Pxr對代謝酶表達的調(diào)控作用。以往研究多基于炎癥對代謝酶表達的短期影響,有關(guān)對子代長期影響的研究尚無報道。闡明發(fā)育早期暴露炎癥可能產(chǎn)生的長期影響,對指導(dǎo)臨床合理用藥具有十分重要的意義。本課題擬從DOHaD學(xué)說的角度探討小鼠孕期暴露LPS是否影響不同年齡子代小鼠肝藥物代謝酶基因的表達,并填補有關(guān)孕期發(fā)生炎癥對藥物代謝長期影響的認知不足,為合理用藥提供新策略。該研究主要從以下兩個方面展開:(1)孕期暴露LPS對10天齡(新生兒期)、30天齡(青少年時期)和60天齡(成年期)子代鼠肝藥物代謝酶及炎癥相關(guān)基因表達的影響。(2)孕期暴露LPS對子代鼠肝代謝酶發(fā)育模式的影響。研究方法以C57BL/6小鼠為研究對象,建立LPS炎癥模型,生理鹽水為溶媒對照。C57BL/6雌鼠在孕期第10天隨機分為兩組,分別單劑量腹腔注射100μg·kg~-11 LPS或10 ml·kg~(-1)生理鹽水。在子代小鼠出生后第10、30和60天收取其肝臟組織,使用TR-qPCR檢測炎癥相關(guān)基因(NF-κB和IL-6)、核受體(Pxr、Ahr和Car等)及藥物代謝酶(Cyp3a11、2b10、1a2、Sult1e1和Ugt1a1等)mRNA表達;采用Western-Blot技術(shù)檢測Cyp3a11和1a2的蛋白表達水平。研究結(jié)果1.孕期暴露LPS對不同年齡子代鼠肝臟中炎癥相關(guān)基因NF-κB與IL-6 mRNA表達水平的影響與同齡對照組相比,LPS處理組10天齡子代雌性小鼠肝臟中NF-κB與IL-6 mRNA表達水平高于對照組,而60天齡卻顯著低于對照組(n=4-6/組,P0.05);30天子代雄性小鼠肝臟中NF-κB mRNA表達水平顯著高于對照組,而60天齡組卻顯著低于對照組(n=5-11/組,P0.05)。LPS處理組,10和30天齡子代雄性小鼠肝IL-6 mRNA表達水平高于對照組,60天齡低于對照組,但無統(tǒng)計學(xué)意義。2.孕期暴露LPS對新生兒期子代鼠肝核受體及藥物代謝酶表達的影響:mRNA表達水平:與對照組相比,處理組10天齡子代小鼠肝核受體Pxr、Car及代謝酶Cyp3a11、1a2、2ab10、Ugt1a1和Sult1e1的mRNA表達水平均顯著升高(n=4-8/組,P0.05)。該結(jié)果與炎癥因子NF-κB與IL-6 mRNA表達水平相一致。蛋白表達水平:與對照組相比,處理組10天齡子代小鼠肝代謝酶Cyp3a11和1a2蛋白表達水平顯著升高,與mRNA相對表達水平一致(n=4-8/組,P0.05)。3.孕期暴露LPS對青少年時期子代鼠肝核受體及藥物代謝酶表達影響:mRNA表達水平:與對照組相比,30天齡子代雌雄小鼠肝代謝酶Cyp1a2和Sult1e1 mRNA表達水平顯著性升高;肝核受體Car和代謝酶Cyp3a11 mRNA表達水平顯著性降低(n=4-11/組,P0.05)。雌性小鼠肝Ugt1a1 mRNA表達水平明顯低于對照組(n=4-11/組,P0.01);雄性小鼠肝Ugt1a1 mRNA表達水平無變化(n=4-11/組P0.05)。Cyp2ab10 mRNA表達水平僅在雄性小鼠中顯著高于對照組(n=4-11/組,P0.01),而在雌性小鼠中無統(tǒng)計學(xué)意義。肝核受體Ahr表達水平僅在雄性小鼠中顯著降低(n=5-11/組,P0.01),而Pxr和Car的mRNA表達處理組與對照組無統(tǒng)計學(xué)意義。蛋白表達水平:相對于對照組,30天齡子代雌雄小鼠肝代謝酶Cyp3a11蛋白表達水平顯著性降低;子代雄鼠肝代謝酶Cyp1a2蛋白表達水平顯著性升高(n=4-8/組,P0.05)。與對應(yīng)基因的mRNA相對表達水平一致。4.孕期暴露LPS對成年期子代鼠肝核受體及藥物代謝酶表達影響:mRNA表達水平:與對照組相比,處理組60天齡子代雌雄小鼠肝代謝酶Cyp1a2、2b10和Ugt1a1 mRNA表達水平顯著降低(n=5-6/組,P0.05)。雌性小鼠肝核受體Pxr和代謝酶Cyp3a11、Sult1e1 mRNA表達水平明顯高于對照組(n=5-6/組,P0.01);而雄性小鼠中無統(tǒng)計學(xué)意義。處理組雌性小鼠肝核受體Car mRNA表達水平顯著高于對照組(n=5-6/組,P0.001),而在處理組雄性小鼠中低于對照組(n=4-6/組,P0.05)。蛋白表達水平:與mRNA相對表達水平一致,處理組子代雌性小鼠肝代謝酶Cyp3a11蛋白表達水平顯著高于對照組,Cyp1a2蛋白表達水平低于對照組(n=4-8/組,P0.05);處理組雄性小鼠肝代謝酶Cyp3a11蛋白表達水平顯著性降低,Cyp1a2蛋白表達水平顯著性升高(n=5-7/組,P0.05),該結(jié)果與mRNA相對表達水平不一致。5.孕期暴露LPS對子代鼠肝核受體及藥物代謝酶發(fā)育表達模式的影響:子代雌性小鼠:在對照組子代雌鼠中,核受體Pxr、Ahr、Car和代謝酶Cyp3a11、Ugt1a1、Sult1e1在青少年期表達水平較高;代謝酶Cyp1a2、2b10在成年期表達水平較高。對于處理組子代雌鼠,核受體Ahr mRNA表達水平在新生兒期表達水平較高;核受體Pxr和代謝酶Cyp1a2、Ugt1a1、Sult1e1在青少年期表達水平較高;核受體Car和代謝酶Cyp3a11、2b10在成年期表達水平較高。子代雄性小鼠:在對照組子代雄鼠中,核受體Pxr、Ahr、Car和代謝酶Cyp3a11、2b10、Ugt1a1、Sult1e1在青少年期表達水平較高;代謝酶Cyp1a2在成年期表達水平較高。對于處理組子代雌鼠,核受體Ahr mRNA表達水平在新生兒期表達水平較高;核受體Pxr和代謝酶Cyp1a2、2b10、Ugt1a1、Sult1e1在青少年期表達水平較高;代謝酶Cyp3a11在青少年期和成年期表達水平較高;核受體Car在新生兒期和青少年期表達水平較高。6.子代鼠肝臟中NF-κB與代謝酶相關(guān)基因在mRNA表達水平的相關(guān)性在對照組子代小鼠肝臟中,NF-κB與Pxr、Car、Cyp2b10、Ugt1a1和Sult1e1在mRNA表達水平的相關(guān)性很低(|r|0.23),且無統(tǒng)計學(xué)意義;處理組子代小鼠中,NF-κB與Pxr在mRNA表達水平存在中度正相關(guān)性(r=0.47,P0.001);與Car存在弱負相關(guān)性(r=-0.31,P0.05);與Cyp2b10存在中度正相關(guān)性,(r=0.43,P0.01);與Ugt1a1存在弱正相關(guān)(r=0.33,P0.01)。7.子代鼠肝臟中Pxr與代謝酶相關(guān)基因在mRNA表達水平的相關(guān)性在對照組子代小鼠肝臟中,Pxr與Cyp3a11在mRNA表達水平存在高度正相關(guān)性(r=0.74,P0.001);與Cyp1a2 mRNA表達無相關(guān)性(r=0.09);與Sult1e1存在中度正相關(guān)性,(r=0.55,P0.01);與Ugt1a1存在中度正相關(guān)(r=0.59,P0.01)。在處理組子代小鼠中,Pxr與Cyp3a11在mRNA表達水平存在弱正相關(guān)性(r=0.4,P0.01);與Cyp1a2存在高度正相關(guān)性(r=-0.79,P0.001);與Sult1e1存在弱正相關(guān)性,(r=0.28);與Ugt1a1存在高度正相關(guān)(r=0.72,P0.001)。研究結(jié)論孕期暴露LPS顯著影響子代鼠肝臟中炎癥相關(guān)基因(NF-κB和IL-6)、核受體(Pxr等)及代謝酶(Cyp3a11等)的表達水平,且存在性別差異。1.孕期暴露LPS對同一年齡的子代鼠肝核受體與代謝酶具有不同程度的上調(diào)或下調(diào)作用。2.孕期暴露LPS對不同年齡子代鼠肝臟中相同的代謝酶基因具有不同程度的上調(diào)或下調(diào)作用,且干擾子代小鼠肝發(fā)育成熟過程中代謝酶的發(fā)育表達模式。3.孕期暴露LPS,其子代鼠肝臟中NF-κB與Pxr、Car、Cyp2b10和Ugt1a1mRNA表達水平存在相關(guān)性。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：
60 天齡顯著降低（圖 1A）；30天齡子代雄性小鼠肝 NF-κB mRNA 表達水平顯著升高，60 天齡顯著降低（圖1B）。10 天齡子代雌性小鼠肝 IL-6mRNA 表達水平顯著升高，60 天齡顯著降低（圖 1C）。10 天齡子代雄性小鼠肝 IL-6 表達水平高于對照組，60 天齡低于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異（圖 1D）。
16圖 2 孕期暴露 LPS 對 10 天齡子代鼠肝核受體及代謝酶 mRNA 表達的影響A：10 天齡子代雌鼠肝核受體及代謝酶 mRNA 表達水平（n=4-8/組）；B：10 天齡子代雄鼠肝核受體及代謝酶 mRNA 表達水平（n = 4-8/組）。*P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs. NC-10。NC-10：對照組 10 天齡子代小鼠，LPS-10：處理組 10 天齡子代小鼠。4.2.2 孕期暴露 LPS 對 10 天齡子代鼠肝 Cyp3a11 及 1a2 蛋白表達的影響為探究孕期暴露 LPS 對 10 天齡子代小鼠肝臟代謝酶 Cyp3a11 和 1a2 蛋白表達水平的影響。使用 Western-Blot 技術(shù)檢測 10 天齡子代小鼠肝代謝酶 Cyp3a11和 1a2 蛋白表達水平。結(jié)果表明：與對照組相比，孕期雌鼠給予 LPS 處理后，其 10 天齡子代鼠肝臟代謝酶 Cyp3a11 和 1a2 蛋白表達水平均顯著升高（圖 3、4）。
圖 3 孕期暴露 LPS 對 10 天齡子代鼠肝臟 Cyp3a11 蛋白表達水平的影響A：10 天齡子代雌性小鼠肝臟代謝酶 Cyp3a11 蛋白表達水平（n=4-5/組）；B：10 天齡子代雄性小鼠肝臟代謝酶 Cyp3a11 蛋白表達水平，（n=4-8/組）。*P<0.05**P<0.01vs.NC-10。NC-10：對照組 10 天齡子代小鼠，LPS-10：處理組 10 天齡子代小鼠。圖 4 孕期暴露 LPS 對 10 天齡子代鼠肝臟代謝酶 Cyp1a2 蛋白表達水平的影響
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本文編號：
2882693
