發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 08:17

　　 過量的活性氧(ROS)水平對(duì)身體有害,ROS的形成和消除之間的不平衡在許多人類疾病的發(fā)病機(jī)理中起作用,例如缺血/再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病、癌癥和過敏等。谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)是用于預(yù)防ROS誘導(dǎo)的損傷的重要抗氧化酶。SOD催化超氧陰離子(O_2~(·-))歧化為氧氣(O_2)和過氧化氫(H_2O_2),然后通過GPx將H_2O_2分解成水。這兩種抗氧化酶除了具有協(xié)同的催化功能之外,它們又彼此保護(hù),可以更有效地去除活性氧物質(zhì),保護(hù)細(xì)胞免受損傷,并維持活性氧物質(zhì)的正常代謝。龐貝蠕蟲來源SOD(ApSOD)是從海底熱泉中的龐貝蠕蟲中分離純化的一種金屬酶,其金屬輔助因子為Cu和Zn。與人SOD(HsSOD)相比,ApSOD具有更高的穩(wěn)定性,更適合科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)應(yīng)用。人胃腸道來源GPx(hGPx2)是一種硒蛋白,硒蛋白的催化功能依賴于其活性中心的硒代半胱氨酸(Sec),天然的Sec由作為終止密碼子的UGA編碼,而且需要復(fù)雜的編碼機(jī)制才能將UGA低效的翻譯為Sec。因此,細(xì)胞利用自身的機(jī)制很難大量表達(dá)外源含硒GPx。我們課題組在之前的研究中,利用半胱氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷表達(dá)系統(tǒng)和單一蛋白質(zhì)生產(chǎn)(SPP)系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用來表達(dá)GPx,成功的將Sec替代Cys插入到肽鏈中獲得了較高活力的含硒GPx,然而這種方法只能獲得缺失Cys的突變體,再加上成本高且耗時(shí),不利于對(duì)含硒蛋白的廣泛研究。本研究為了制備具有協(xié)同作用的hGPx2和ApSOD活性的雙功能酶,選擇了一段含21個(gè)氨基酸的柔性肽Ser(Gly4Ser)*4作連接Linker,其中甘氨酸分子量最小,肽鏈最短,可提高Linker的柔性度,而絲氨酸是親水性最強(qiáng)的氨基酸,利于蛋白保持可溶性。本研究選用的Linker比本課題組之前使用的增加了5個(gè)氨基酸GGGGS,適當(dāng)延長(zhǎng)Linker可能更有利于減弱hGPx2和ApSOD對(duì)彼此結(jié)構(gòu)的影響。先用基因工程方法獲得hGPx2和ApSOD基因,再將兩者構(gòu)建在分泌型原核表達(dá)載體pRSF Duet-1上,然后,將構(gòu)建成功的質(zhì)粒與裝載Sec摻入蛋白質(zhì)的組件的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化UAG工程菌,在亞硒酸鈉存在下誘導(dǎo)表達(dá)。UAG工程菌即琥珀型終止缺陷大腸桿菌C321.ΔA.exp,是將大腸桿菌中負(fù)責(zé)UAG終止的釋放因子1(RF1)去除,并將基因組中321個(gè)UAG終止密碼子替換為UAA終止密碼子的工程菌,使得UAG在這一菌株中真正地被賦予編碼氨基酸的能力。最終通過鎳親和層析法分離純化出具有協(xié)同作用的hGPx2和ApSOD活性的雙功能融合蛋白。該融合蛋白具有更高的GPx和SOD活性。每種酶都具有特定的不可替代的功能,它們以協(xié)同的方式起作用,更好地保護(hù)機(jī)體免受損傷。因此,多功能抗氧化劑的設(shè)計(jì)和生成將成為人工酶領(lǐng)域發(fā)展的重要課題。我們預(yù)期具有協(xié)同作用的肽酶有望用于治療人類疾病,并且在醫(yī)學(xué)中作為有效的抗氧化劑具有潛在的應(yīng)用。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R915
【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 活性氧
        1.1.1 活性氧概述
        1.1.2 活性氧的產(chǎn)生與代謝
        1.1.3 活性氧與健康
    1.2 硒與硒蛋白
        1.2.1 硒的概述
        1.2.2 硒蛋白
        1.2.3 硒蛋白與健康
        1.2.4 Sec的生物合成
        1.2.5 Sec摻入蛋白質(zhì)的機(jī)制和調(diào)節(jié)
    1.3 谷胱甘肽過氧化物酶
    1.4 超氧化物歧化酶
    1.5 具有協(xié)同作用的抗氧化模擬酶
    1.6 立題依據(jù)
第2章 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
    2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)菌株
    2.4 試劑配制
    2.5 實(shí)驗(yàn)方法
40UAG-Linker-Ap SOD重組質(zhì)粒的構(gòu)建'>        2.5.1 p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.5.2 融合蛋白的含硒表達(dá)
        2.5.3 鎳親和層析法純化蛋白
        2.5.4 目的蛋白的SDS-PAGE和Western Blot鑒定
        2.5.5 蛋白含量的測(cè)定
        2.5.6 蛋白活力測(cè)定
第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
40UAG-Linker-Ap SOD質(zhì)粒的構(gòu)建'>    3.1 p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD質(zhì)粒的構(gòu)建
40UAG-Linker-Ap SOD基因'>        3.1.1 重疊PCR獲取h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD基因
40UAG-Linker-Ap SOD重組質(zhì)粒'>        3.1.2 構(gòu)建p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD重組質(zhì)粒
40UAG-Linker-Ap SOD重組質(zhì)粒'>        3.1.3 鑒定p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD重組質(zhì)粒
40UAG-Linker-Ap SOD質(zhì)粒的表達(dá)及純化'>    3.2 p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD質(zhì)粒的表達(dá)及純化
40UAG-Linker-Ap SOD的濃度及活力測(cè)定'>    3.3 p RSF-h GPx2_40UAG-Linker-Ap SOD的濃度及活力測(cè)定
第4章 討論
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
創(chuàng)新點(diǎn)
作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果
致謝

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