發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 17:21

　　 目的:蛋白質(zhì)藥物在癌癥等多種疾病的治療方面起著重要作用,然而由于蛋白質(zhì)藥物存在入胞效率低等問題,使其療效和應(yīng)用受到了限制。為了解決蛋白藥物入胞難的問題,本課題構(gòu)建了一種穿膜肽介導(dǎo)透膜的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)響應(yīng)的蛋白質(zhì)藥物胞內(nèi)遞送系統(tǒng),擬借助具有較強(qiáng)穿膜和攜載能力的細(xì)胞穿膜肽(CPPs)來提高蛋白質(zhì)藥物的入胞效率,并引入對腫瘤相關(guān)蛋白酶MMPs具有特異性響應(yīng)的蛋白酶酶切位點(diǎn),對穿膜肽的功能進(jìn)行選擇性控制,彌補(bǔ)細(xì)胞穿膜肽無細(xì)胞選擇性的缺點(diǎn),優(yōu)勢互補(bǔ),實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)所攜載的蛋白藥物對腫瘤細(xì)胞的選擇性、高效性入胞。內(nèi)容:本論文完成了遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建及表征,并對遞藥系統(tǒng)的酶響應(yīng)性和靶向性進(jìn)行了體內(nèi)外研究,進(jìn)而對系統(tǒng)的安全性進(jìn)行了評價(jià)。方法:1.遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建及表征。遞藥系統(tǒng)的蛋白部分利用E.coli原核表達(dá)體系融合表達(dá),并通過親和純化獲得。磁性納米粒載體部分通過水熱法制備得到,并采用XRD、EDX、TEM、DLS及測定磁滯回線等方法對其物相、形貌、分散性和磁化強(qiáng)度等進(jìn)行表征。同時(shí)通過熒光測定、SDS-PAGE膠分離等方法對融合蛋白與納米粒的結(jié)合能力、結(jié)合特異性進(jìn)行了考察,并通過熒光滴定法考察納米粒對熒光蛋白的淬滅效率,以確定系統(tǒng)的組裝比例。2.遞藥系統(tǒng)的酶響應(yīng)性及靶向性考察。1)酶水平:通過測定遞藥系統(tǒng)在人源重組MMP-2催化下所釋放的熒光蛋白量,考察系統(tǒng)的酶響應(yīng)性;2)細(xì)胞水平:通過細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)考察系統(tǒng)的酶響應(yīng)性。3)體內(nèi):采用原位和靜脈注射兩種給藥方式,考察荷瘤裸鼠腫瘤部位遞藥系統(tǒng)的分布,及在CPP攜載下蛋白質(zhì)藥物mCherry入胞效果。3.遞藥系統(tǒng)安全性評價(jià)。通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證遞藥系統(tǒng)的細(xì)胞毒性。并將構(gòu)建系統(tǒng)按成像劑量于兩周內(nèi)對昆明鼠兩次給藥,觀察此期間小鼠的體重變化,且給藥兩周后,對動(dòng)物臟器系數(shù)和主要臟器病理切片進(jìn)行系統(tǒng)的安全性分析。結(jié)果:1.遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建及表征。SDS-PAGE表明,融合蛋白的表觀分子量約為32 kDa,與理論計(jì)算值一致,Western Blot結(jié)果確認(rèn)了融合蛋白C端組氨酸標(biāo)簽的存在。XRD以及EDX譜圖確定了NiFe_2O_4磁性納米粒的晶型及元素組成。納米粒的DLS分析表明其水合粒徑約為131.2±0.9 nm,TEM顯示其平均粒徑約為80.3±3.0 nm,磁滯回線顯示其飽和磁化強(qiáng)度為47.51 emu/g,可應(yīng)用于遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建和磁靶向給藥。融合蛋白與納米粒結(jié)合能力、結(jié)合特異性考察實(shí)驗(yàn)證明了兩部分結(jié)合的特異性。構(gòu)建系統(tǒng)的水合粒徑約為192.8±5.3 nm,平均粒徑約為86.5±5.6 nm,有利于磁靶向和實(shí)現(xiàn)體內(nèi)EPR效應(yīng)。熒光淬滅效率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,遞藥系統(tǒng)的最佳組裝比例為融合蛋白:NiFe_2O_4磁性納米粒為1.0:8.3(W/W)。2.遞藥系統(tǒng)的酶響應(yīng)性及靶向性考察。體外酶響應(yīng)性實(shí)驗(yàn)中,與對照系統(tǒng)相比,遞藥系統(tǒng)在重組人源MMP-2作用下,體系所產(chǎn)生的熒光隨時(shí)間延長而增強(qiáng),表明系統(tǒng)能有效被MMP-2所激活并釋放出CPP-mCherry偶聯(lián)物。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中,高表達(dá)MMP-2的HT-1080細(xì)胞相比低表達(dá)MMP-2的MCF-7細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的紅色熒光,表明所構(gòu)建的遞藥系統(tǒng)能在腫瘤細(xì)胞表達(dá)的MMP-2作用下釋放CPP-mCherry偶聯(lián)物,使mCherry在CPP攜載下跨膜入胞。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤比對照組(MMP-2酶切位點(diǎn)突變組)熒光強(qiáng)度強(qiáng),并且施加磁場組比無磁場組熒光強(qiáng)度更強(qiáng),此結(jié)果表明,在磁場和EPR效應(yīng)作用下,遞藥系統(tǒng)得以在腫瘤部位聚集,并在腫瘤部位高表達(dá)的MMP-2作用下,促使透膜性CPP去屏蔽并攜載mCherry進(jìn)入細(xì)胞。以上結(jié)果表明,所構(gòu)建遞藥系統(tǒng)具有較好的酶響應(yīng)性和體內(nèi)靶向性。3.遞藥系統(tǒng)的安全性評價(jià)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示,系統(tǒng)對于正常細(xì)胞無明顯生長抑制,當(dāng)給藥濃度達(dá)200μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率仍在70%以上。而小鼠毒性實(shí)驗(yàn)顯示,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組昆明鼠的體重和臟器系數(shù)無明顯差異。取主要臟器病理切片分析,結(jié)果顯示,與PBS對照組相比,實(shí)驗(yàn)組主要臟器心、肝、脾、肺、腎均無明顯病理變化,表明構(gòu)建遞藥系統(tǒng)具較好生物相容性。結(jié)論:本課題構(gòu)建了一個(gè)MMP-2響應(yīng)的CPP介導(dǎo)透膜的蛋白質(zhì)藥物胞內(nèi)靶向遞送系統(tǒng),并分別從酶水平、細(xì)胞水平及動(dòng)物水平系統(tǒng)研究了該系統(tǒng)的酶響應(yīng)性和靶向性。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示,在MMP-2激活下,該系統(tǒng)能較好地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)藥物的腫瘤胞內(nèi)靶向遞送。此外,系統(tǒng)的生物相容性分析結(jié)果表明,該系統(tǒng)具有較好的生物相容性,具備臨床應(yīng)用的巨大潛力。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R943
【部分圖文】：

士學(xué)位論文 一. 融合蛋白 1 h 后，4°C 冰箱中過夜。次日，用 TBST 工作液將 3 次。二抗用 TBST 工作液按比例稀釋，將 PVDF 膜浸泡其后，將 PVDF 膜置于 TBST 中，清洗 10 min，重復(fù)：超敏 ECL 發(fā)光試劑盒中 A、B 液體以 1:1 的比例混避光孵育 1 min，用顯影儀進(jìn)行顯影。的鑒定

以上溶液混合，稱取 0.9 gKNO3溶于 6 mL 純水中，緩慢30 min 后移至反應(yīng)釜內(nèi)襯中，封口，200°C 反應(yīng) 16 h。反室溫，無水乙醇清洗 3-4 次后 60°C 真空烘干 10 h。2O4磁性納米粒的表征干燥后的 NiFe2O4磁性納米粒用研缽研細(xì)，采用 D/MAX 2RD）對樣品進(jìn)行檢測，分析晶形結(jié)構(gòu)。測試條件：工作電 100 mA，掃描范圍為 10-80 °，掃速為 8 °/min。同樣，取 PPMS-9 物理性能測試儀進(jìn)行磁性的測試。量磁性納米粒超聲分散于純水中，TEM 專用鎳夾取 C 支，吸取 50 μL溶液慢慢滴至銅網(wǎng)上，放置于干燥地方，晾磁性納米粒的形貌，并用EDX（Energy Dispersive X-Raysp析。剩余的納米粒分散溶液可用于粒度測試儀測水合粒徑2O4磁性納米粒的物相分析

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 二、NiFe2O4磁性納米粒的制備及其表征如圖 2.1 所示，通過 X 射線衍射儀得到了樣品的晶型結(jié)構(gòu)，樣品的（111），（220），（311），（400）等晶面的衍射峰位置以及大小與標(biāo)準(zhǔn)卡片 JCPDS 86-2267相吻合，由此可推斷出，樣品為 NiFe2O4。2.2.2 NiFe2O4磁性納米粒的粒徑分析
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;蛋白質(zhì)藥物如何發(fā)揮作用[J];山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2001年06期

2 吳進(jìn)龍;;肽與蛋白質(zhì)藥物的劑型及其給藥途徑[J];藥學(xué)進(jìn)展;1988年02期

3 田雪華;周芳;;蛋白質(zhì)藥物口服的研究進(jìn)展[J];臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志;2018年48期

4 朱迅;;蛋白質(zhì)藥物的功能分類及發(fā)展趨勢[J];中國醫(yī)藥生物技術(shù);2010年01期

5 ;蛋白質(zhì)藥物:新世紀(jì)的朝陽產(chǎn)業(yè)[J];中國新技術(shù)新產(chǎn)品;2008年04期

6 李瀟;;基因工程雞產(chǎn)下含蛋白質(zhì)藥物的蛋[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2007年12期

7 馬利敏,張強(qiáng),李玉珍;載多肽和蛋白質(zhì)藥物的納米粒給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J];中國藥學(xué)雜志;2000年07期

8 蘭文軍;舉足輕重的蛋白質(zhì)藥物[J];開卷有益(求醫(yī)問藥);1996年03期

9 張林;李兆明;陳超;顏東;董世波;;納米凝膠作為蛋白質(zhì)藥物載體的研究進(jìn)展[J];食品與藥品;2017年01期

10 孟曉光;甄里;劉悅玫;侯利平;劉丹;李斌;歐陽偉民;魏開華;;全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳分析蛋白質(zhì)藥物電荷異質(zhì)性[J];分析測試學(xué)報(bào);2017年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 劉尚義;親和層析與生物質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)藥物分析中的應(yīng)用研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2002年

2 溫靜;新型蛋白納米膠囊設(shè)計(jì)、制備及應(yīng)用研究[D];天津大學(xué);2012年

3 周展;分子修飾技術(shù)構(gòu)建長效/靶向蛋白質(zhì)藥物[D];中國科學(xué)院研究生院(過程工程研究所);2016年

4 吳玲;聚乙二醇/聚乙二醇—脂肪烷定點(diǎn)修飾生長激素和生長激素拮抗劑N末端的研究[D];中國科學(xué)院研究生院(過程工程研究所);2015年

5 陳景;光點(diǎn)擊化學(xué)法構(gòu)建的多功能透明質(zhì)酸納米/微米凝膠用于蛋白質(zhì)藥物的腫瘤靶向高效治療[D];蘇州大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前9條

1 高婷婷;纖維素MONOLITH材料的制備及其在蛋白質(zhì)藥物分離純化中的應(yīng)用[D];江蘇大學(xué);2018年

2 解樹平;酶響應(yīng)的蛋白質(zhì)藥物胞內(nèi)靶向遞送系統(tǒng)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

3 劉映薇;口服蛋白質(zhì)藥物AC緩釋微球的膜性能研究[D];中國科學(xué)院研究生院（大連化學(xué)物理研究所）;2004年

4 邊蕾;利用噬菌體表面展示技術(shù)篩選黏附人血清白蛋白的功能肽的研究[D];大連工業(yè)大學(xué);2009年

5 王洲;PEG修飾人重組粒細(xì)胞集落刺激因子的制備工藝及性質(zhì)研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 汪一娟;聚陰離子/兩性殼聚糖復(fù)合物用于蛋白質(zhì)藥物pH響應(yīng)性釋放[D];浙江大學(xué);2005年

7 萬勝利;AHLP的制備及質(zhì)量初步評價(jià)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

8 黃可可;蛋白質(zhì)藥物的海藻酸鈣/殼聚糖微球控釋載體制備及性能研究[D];西北大學(xué);2006年

9 李少科;壁膜可電離的生物可降解聚合物囊泡的便捷制備、蛋白質(zhì)和疏水抗癌藥物的高效裝載及內(nèi)涵體pH刺激下藥物的高效細(xì)胞內(nèi)釋放[D];蘇州大學(xué);2012年

本文編號：2883740