發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 07:27

　　 單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一種食源性病原菌,革蘭氏染色陽性,在人體內(nèi)主要以胞內(nèi)感染形式存在。單增李斯特菌感染后可以引起腦膜腦炎,菌血癥和敗血癥。雖然慶大霉素、卡那霉素對單增李斯特菌有抑制作用,但是抗生素的濫用會導(dǎo)致耐藥菌的出現(xiàn),因此急需尋求新的抑菌因子。噬菌體裂解酶(Bacteriophage lysin)是噬菌體感染宿主后期表達(dá)的可以裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖水解酶類。天然的李斯特菌裂解酶不僅具有較強(qiáng)的種屬特異性并且不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。但是天然李斯特裂解酶的活性大多比較低,因此急需發(fā)展高效的單增李斯特菌裂解酶。本研究通過將細(xì)胞穿透肽Tat與李斯特裂解酶Ply511融合發(fā)展了一種活性增強(qiáng)的李斯特裂解酶Ply511-N2。100μg/mL Ply511-N2能在60 min內(nèi)使單增李斯特菌活菌數(shù)降低1-3個(gè)Log值,但是不能入胞殺菌。并且酶學(xué)性質(zhì)表明,Ply511-N2能在溫度為4-45℃和pH為6.0-11.0時(shí)保持良好的活性。Ply511-N2對李斯特菌有較高的特異性,對單增李斯特菌有良好的殺菌效果,對無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌的活性較差。Ply511-N2在250μg/mL以下時(shí)對中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)毒性較低,實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞保持了超過90%的活性。目前檢測李斯特菌的方法因儀器昂貴,操作復(fù)雜,無法滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。本研究第二部分結(jié)合前一部分發(fā)展的裂解酶,利用生物體內(nèi)ATP作為檢測靶標(biāo)發(fā)展了一種新型的李斯特菌檢測方法,不僅特異性和靈敏性較高,而且簡單易操作,不需要昂貴的儀器和專業(yè)的技術(shù)人員。由于Ply511-N2對單增李斯特菌具有較高的特異性,Ply511-N2檢測單增李斯特菌時(shí)有ATP升高的現(xiàn)象,而檢測金黃色葡萄球菌時(shí)沒有ATP升高的現(xiàn)象。這種檢測方法對單增李斯特菌的檢測靈敏度可以達(dá)到10~4-10~5 CFU/mL。下一步希望對這種檢測方法做更多的優(yōu)化。本研究通過細(xì)胞穿透肽Tat序列與Ply511序列融合表達(dá)發(fā)展了一個(gè)活性比親本裂解酶增強(qiáng)的裂解酶,并利用該嵌合裂解酶發(fā)展了一種單增李斯特菌快速檢測的新方法,為進(jìn)一步探索基于噬菌體裂解酶的李斯特菌治療和快速檢測打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：武漢輕工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R91
【部分圖文】：

重度污染食物約 20 h 后開始，李斯特菌在體內(nèi)潛伏期大個(gè)體潛伏期更長[15]。在初始階段，細(xì)菌主要在絨毛頂端后期大多數(shù)出現(xiàn)在腸絨毛的巨噬細(xì)胞中。但是致病性李道內(nèi)形成明顯的組織損傷[12]。表明單增李斯特菌不會在染。攝入后，單核細(xì)胞增生李斯特菌能夠穿過腸上皮并更深的組織[16, 17]。在腸道中，通過細(xì)胞侵入到鄰近的細(xì)障的李斯特菌被淋巴和血液攜帶到腸系膜淋巴結(jié)，脾臟特菌入侵肝臟后會被一些巨噬細(xì)胞殺死[12]。在最初感染表面的吞噬細(xì)胞即庫普弗細(xì)胞（Kupffer cell）激起細(xì)胞菌，存活的細(xì)菌繼續(xù)增殖[9]。在肝臟中細(xì)菌增殖的主要被認(rèn)為是李斯特菌從腸道轉(zhuǎn)移后的第一個(gè)靶器官[10]。單歷完整的細(xì)胞內(nèi)感染循環(huán)。在衰弱和免疫功能低下的患菌不受限制地增殖可能導(dǎo)致低水平的菌血癥[9]，將會進(jìn)例如腦和妊娠子宮[20]。

單核增生李斯特菌是胞內(nèi)寄生菌。目前沒有發(fā)現(xiàn)可以入胞殺死李斯特菌的裂解酶和抗生素，因此我們希望將一段能入胞的細(xì)胞穿透肽與現(xiàn)有的李斯特菌裂解酶融合表達(dá)，發(fā)展重組的噬菌體裂解酶。在本研究中我們采用了細(xì)胞穿透肽 Tat（YGRKKRRQRRR）和一段合成的細(xì)胞穿透肽（KAAILCRRLRD）與噬菌體裂解酶進(jìn)行融合表達(dá)了 3 種蛋白，并測試了 3 種嵌合體殺滅胞外以及胞內(nèi)菌的活性。只有重組蛋白 Ply511-N2 具有較好的殺菌活性，而且高于親本裂解酶。但是，Ply511-N2 不能入胞殺菌。由于重組裂解酶 Ply511-N2 具有更好的活性和特異性，因此我們進(jìn)一步將它用于單增李斯特菌的檢測。本研究采取生物發(fā)光的原理，借助熒光素酶能與 ATP 發(fā)生反應(yīng)的特性來檢測環(huán)境中存在的李斯特菌。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)細(xì)菌裂解時(shí)會釋放出大量的 ATP 這一生物特性，建立一種能快速特異檢測李斯特菌的方法（如圖 1.2 所示）。該檢測方法檢測時(shí)間短，不需要長時(shí)間的增菌培養(yǎng)，不需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，能夠區(qū)分活菌和死菌，有望應(yīng)用于食品行業(yè)中單增李斯特菌的檢測。本研究建立的檢測方法仍然需要進(jìn)一步的優(yōu)化，提高對環(huán)境中單增李斯特菌定量的準(zhǔn)確性。

武漢輕工大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文MTT 的配置：避光條件下，用分析天平精密稱取 50 mg 的 MTT 粉末于 15mL 離心管中，加入 10 mL PBS，配置成 5 mg/mL ，PH 在 7.4-7.6 范圍內(nèi)的MTT 工作液。完全溶解后，用無菌 0.22 μm 的濾膜過濾后分裝于棕色 1.5 mLEP 管中，-20℃ 保存，兩個(gè)月內(nèi)有效。使用前 37℃ 水浴解凍。引物的溶解：目的基因用離心機(jī)瞬時(shí)離心，按引物說明書加入對應(yīng)體積的無菌蒸餾水，配置成 10 μM 的濃度，分裝后-20℃保存，使用時(shí)可放 4℃暫時(shí)保存。2.3 重組裂解酶表達(dá)載體構(gòu)建
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