發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 04:37

　　 少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte,OL)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中的成髓鞘細(xì)胞,由少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cell,OPC)分化而來。髓鞘的形成不僅為神經(jīng)元間高速快捷的電信號傳導(dǎo)所必須,還為軸突提供營養(yǎng)支持,保護(hù)軸突完整性。OL對多種內(nèi)外環(huán)境的損傷因素敏感,易發(fā)生細(xì)胞損傷、功能失調(diào)甚至凋亡,導(dǎo)致嚴(yán)重的脫髓鞘疾病,甚至精神疾病,如:多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)、精神分裂癥等。髓鞘損傷的修復(fù)依賴于OPC,這些細(xì)胞均勻分布于CNS,且維持前體細(xì)胞的特征,可在損傷情況下增殖,并分化為成熟OL,修復(fù)受損的髓鞘,即髓鞘再生(Remyelination)。但由于細(xì)胞微環(huán)境中的抑制性信號分子等原因,OPC分化常常受到抑制,而不能完成髓鞘再生。因此,研究促進(jìn)OPC分化和髓鞘再生對于CNS脫髓鞘疾病的治療方法有著重要的科學(xué)意義。其中,發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)OPC分化和髓鞘修復(fù)再生的藥物或藥物靶點(diǎn)也是神經(jīng)科學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究關(guān)注的重要科學(xué)難題之一。篩選能促進(jìn)OPC分化的藥物或化合物是促進(jìn)髓鞘再生治療最直接的方法之一。傳統(tǒng)方法利用細(xì)胞培養(yǎng),逐一篩查藥物其對OPC分化的影響。該方法的弊端是過程耗時(shí)耗力,而且效果也難以同其他藥物或化合物相比較,進(jìn)行優(yōu)中選優(yōu)。為了滿足對挖掘藥物的高效、高質(zhì)量的要求,有必要建立一種新的篩選方法。最新的高通量篩選技術(shù)是篩選并挖掘有效藥物及化合物作用及其機(jī)制的有效方法。其中,二元指示髓鞘化納米微柱陣列(Binary Indicant for myelination using Micropillar Arrays,BIMA)技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)對髓鞘形成藥物的大批量篩選。且高通量技術(shù)(如RNA微陣列)能為我們提供更多、更完整的關(guān)于具體生物過程的基因表達(dá)信息,幫助我們更好的理解生物過程背后的作用機(jī)制。通過與國外實(shí)驗(yàn)室合作,我們成功建立了該篩選體系。本研究中,我們應(yīng)用BIMA系統(tǒng)篩選了大量藥物和化合物。發(fā)現(xiàn)非典型性抗精神病藥喹硫平(quetiapine,QUE)是其中的一種有力的選藥物,能有效促進(jìn)OPC分化和髓鞘再生。我們進(jìn)一步以QUE作為工具藥,利用微陣列技術(shù)檢測了QUE作用后,OPC分化的基因表達(dá)譜改變及基因本體學(xué)變化特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)重塑復(fù)合體相關(guān)基因可能在OPC分化中發(fā)揮了重要作用。而近年來研究表明,表觀遺傳調(diào)控,尤其以Brg1為代表的染色質(zhì)重塑分子在OPC分化中扮演了重要的角色。為此,我們制備了少突膠質(zhì)細(xì)胞系特異性轉(zhuǎn)基因小鼠,對微陣列分析中發(fā)現(xiàn)的,可能在OPC分化中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的分子,染色質(zhì)重塑分子BAF155的作用進(jìn)行了初步的探討。此外,我們也對BIMA系統(tǒng)篩選發(fā)現(xiàn)的廣譜藥物—阿司匹林是否可促進(jìn)OPC分化和髓鞘形成,以及其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下:(1)利用BIMA系統(tǒng)篩選發(fā)現(xiàn)可能促進(jìn)OPC分化的候選藥物利用最新發(fā)現(xiàn)的高通量髓鞘形成篩選BIMA系統(tǒng)。我們對藥物/化合物庫中200種化合物進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)了一系列能促進(jìn)分化OPC分化的藥物。通過免疫熒光染色和Western Blot等技術(shù),我們對氯馬斯汀、U50488和QUE等幾種能顯著促進(jìn)OPC的分化的藥物進(jìn)行了初步的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)驗(yàn)證。其中我們主要感興趣的是,本實(shí)驗(yàn)室前期研究一直關(guān)注的藥物,非典型性抗精神藥喹硫平QUE。(2)QUE促進(jìn)OPC分化和髓鞘再生通過免疫熒光染色和Western Blot,我們發(fā)現(xiàn),QUE處理后,不僅能促進(jìn)培養(yǎng)OPC分化成熟,也顯著提高了新生大鼠胼胝體區(qū)MBP的表達(dá),促進(jìn)髓鞘形成。而在Cuprizone脫髓鞘模型中,QUE能有效促進(jìn)髓鞘再生,表明QUE是有力的候選藥物,可作為研究促進(jìn)OPC分化和髓鞘再生機(jī)制及藥物靶點(diǎn)的工具藥。(3)微陣列篩查發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)重塑蛋白BAF155參與OPC分化利用微陣列技術(shù),以QUE為工具藥,我們研究了其作用機(jī)制。首先通過OPC正常分化過程中微陣列檢測出的差異基因,我們明確了該技術(shù)能夠更全面地反應(yīng)OPC分化過程中的基因變化和重要的信號通路。通過檢測與OPC正常分化相比較,QUE處理后出現(xiàn)顯著上調(diào)/下調(diào)的基因聚類發(fā)現(xiàn),我們發(fā)現(xiàn)QUE處理后,染色質(zhì)重塑復(fù)合體相關(guān)基因出現(xiàn)明顯下調(diào),與其促進(jìn)OPC分化重要密切相關(guān),通過對相關(guān)基因具體分析,我們發(fā)現(xiàn)BAF155變化最為顯著,可能是調(diào)控OPC分化的關(guān)鍵候選分子。(4)BAF155對調(diào)控OPC的分化具有重要作用我們設(shè)計(jì)并制備了BAF155 flox小鼠。通過與PDGFaRCreERT小鼠雜交,成功獲得可在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞特異性敲除BAF155小鼠(BAF155~(flox/flox),PDGFaRCre+/+)。在發(fā)育過程中使用他莫昔芬誘導(dǎo)特異性敲除OPCs中的BAF155。利用免疫熒光和原位雜交等技術(shù)檢測了BAF155對OPC發(fā)育分化的作用,我們的結(jié)果表明,在OPC中敲除BAF155后,成熟OL標(biāo)志物MBP和MAG表達(dá)下降,說明BAF155在OPC分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,其詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。(5)發(fā)現(xiàn)和鑒定阿司匹林促進(jìn)OPC分化和髓鞘形成的新作用利用培養(yǎng)的OPC,我們發(fā)現(xiàn):阿司匹林處理后,培養(yǎng)OPC中Ki67和PDGFaR雙標(biāo)染色(即增殖OPC)細(xì)胞數(shù)沒有明顯改變,而OL成熟標(biāo)志物MBP陽性細(xì)胞數(shù)明顯增高,細(xì)胞形態(tài)上也表現(xiàn)出成熟OL的特性;新生大鼠腦白質(zhì)發(fā)育模型中,阿司匹林處理后MBP表達(dá)明顯增強(qiáng),表明阿司匹林可促進(jìn)OPC分化好髓鞘形成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),阿司匹林處理后,Wnt/β-catenin信號通路中的重要信號分子,GSK-3表達(dá)水平明顯升高,其下游靶向因子β-catenin磷酸化水平升高,而GSK3β磷酸化水平下降;用QS11,一種選擇性的Wnt/β-catenin信號通路激動劑處理OPC后,OPC分化受到了明顯抑制,而阿司匹林處理能拮抗QS11的作用。以上結(jié)果表明,阿司匹林可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路,促進(jìn)OPC的分化。綜上所述,為了發(fā)現(xiàn)促進(jìn)OPC分化和髓鞘形成的藥物靶點(diǎn),我們利用BIMA系統(tǒng)及微陣列等高通量篩選技術(shù),發(fā)現(xiàn)QUE是一種有效促進(jìn)OPC分化和髓鞘再生的候選藥物,并以QUE為工具藥,發(fā)現(xiàn)了染色質(zhì)重塑復(fù)合體相關(guān)分子BAF155在OPC分化中的重要調(diào)控作用。同時(shí),我們也發(fā)現(xiàn)并闡明了阿司匹林通過抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)OPC分化的作用途徑。以上研究為我們進(jìn)一步挖掘促進(jìn)OPC分化和髓鞘再生藥物的新途徑和新靶點(diǎn)提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 個(gè)復(fù)雜的過程，單純加少量外來物質(zhì)（1μM）不足以外，BIMA 篩選出的藥物或化合物在增殖和分化的作用進(jìn)增殖要么促進(jìn)分化，這個(gè)結(jié)果符合增殖和分化在生物結(jié)果證明了我們建立的 BIMA 高通量篩選體系的有效

24圖 2-3 BIMA 檢測促進(jìn) OPC 分化的代表性藥物示意及效果統(tǒng)計(jì)。A. BIMA 檢測結(jié)果免疫熒光掃描圖示意（紅色熒光標(biāo)記為 PDGFaR，用于標(biāo)記 OPC 細(xì)胞，綠色熒光標(biāo)記為 MBP，用于標(biāo)記成熟 OL）。B. 量化統(tǒng)計(jì)免疫熒光掃描圖檢測結(jié)果，數(shù)據(jù)按平均數(shù)（+）標(biāo)準(zhǔn)差形式展示。*與未給予藥物處理組對比，p <0.05。

圖 2-4 免疫熒光染色驗(yàn)證 BIMA 篩選出的藥物效果。A. 培養(yǎng) OPC，加入 QUE，U50488 或氯馬斯汀處理后 6 天時(shí)免疫熒光檢測結(jié)果（紅色熒光標(biāo)記為 PDGFaR，用于標(biāo)記 OPC 細(xì)胞，綠色熒光標(biāo)記為 MBP，用于標(biāo)記成熟 OL，以下相同）。B. 量化統(tǒng)計(jì)藥物處理后陽性 MBP 和 PDGFaR 細(xì)胞數(shù)，反映了細(xì)胞分化情況。數(shù)據(jù)按平均數(shù)（+）標(biāo)準(zhǔn)差形式展示。**與未給予 QUE 組對比，p <0.01。2.3.3 QUE 促進(jìn) CNS 髓鞘發(fā)育和再生為明確 QUE 是否能促進(jìn) CNS 髓鞘發(fā)育，我們對新生 3 天大鼠給予 QUE 灌胃處理，于 7 天和 14 天后取材，免疫熒光染色結(jié)果表明，QUE 處理后，大腦中胼胝體區(qū) MBP明顯增多，Western Blot 結(jié)果也反映了相同趨勢（圖 2-5）。以上結(jié)果表明，QUE 能有效促進(jìn) OPC 分化和髓鞘形成�？紤]到髓鞘再生對藥物治療少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)疾病的重要性，我們檢測了 QUE 在髓鞘再生中的作用。首先，我們按之前本實(shí)驗(yàn)室方法建立了經(jīng)典的 Cuprizone 脫髓鞘模型，喂食 Cuprizone 6 周后中止，結(jié)束脫髓鞘的同時(shí)，給予 QUE（10mg/kg/天）處理。治療 2 周后，用免疫組化的方法檢測胼胝體區(qū) MBP 表達(dá)，結(jié)果表明，相比對照組，QUE
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3 陳慧芳,呂佩源,林嘉友,胡愛祥,李玲,陳競清;實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的致敏抗原——髓鞘素的制備[J];中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)雜志;2002年03期

4 王惠,楊天祝,林嘉友;髓鞘素的提取與鑒定[J];河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2001年01期

5 王維治,王躍紅,梁慶成;多發(fā)性硬化癥髓鞘素組分特異性抗體分泌細(xì)胞[J];中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志;1995年02期

6 曾彥英;顧冰潔;;髓鞘修復(fù)與多發(fā)性硬化[J];國際免疫學(xué)雜志;2007年06期

7 張媛媛,王銘維,顧平;中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘發(fā)育與癲癇的關(guān)系[J];國外醫(yī)學(xué).神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊;2000年04期

8 李華偉,王正敏,沈云珍;小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元髓鞘的發(fā)育[J];聽力學(xué)及言語疾病雜志;1999年02期

9 沈穎;;髓鞘損傷和疾病研究新進(jìn)展國際研討會[J];國際學(xué)術(shù)動態(tài);2016年06期

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9 孫君君;LINGO-1抗體對多發(fā)性硬化模型小鼠髓鞘和認(rèn)知功能的影響[D];東南大學(xué);2017年

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本文編號：2894132