發(fā)布時間：2020-03-23 03:06

【摘要】：目的:沒食子酸(gallic acid,GA)能抵抗心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷,改善心肌肥大和纖維化,并發(fā)揮抗炎作用。然而,沒食子酸對心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)分泌的影響尚不清楚。因此,本研究的目的是利用離體搏動的大鼠心房灌流模型和在體灌注模型觀察沒食子酸對ANP分泌和心房機械活動的影響并探討其作用機制。方法:本實驗采用大鼠離體搏動的心房灌流模型和在體實驗?zāi)Ｐ?利用放射免疫法測定大鼠心房ANP的含量;采用蛋白免疫印跡(western blot,WB)分析心房肌細胞蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)亞型蛋白含量表達的變化。結(jié)果:1.沒食子酸(0.01,0.05,and 0.1μmol/L)以濃度依賴性方式增加ANP的分泌,同時發(fā)揮正性肌力作用(與對照循環(huán)比較,P0.05,n=6),其中0.1μmol/L的沒食子酸效果最強(與對照循環(huán)比較,P0.05,n=6)。而且,沒食子酸(0.1μmol/L)也顯著增加大鼠血漿ANP含量和血流動力學(與對照組比較,P0.05,n=8)。2.沒食子酸上調(diào)心房肌組織PKCβ和PKCε蛋白表達的同時(與對照組比較,均P0.05,n=5),明顯促進ANP的分泌并對心房機械活動發(fā)揮正性肌力作用(與對照循環(huán)比較,均P0.05,n=6)。這些作用可被PKCβ的阻斷劑LY333531(0.5μmol/L)和PKCε的阻斷劑EAVSLKPT(0.3μmol/L)完全阻斷(與GA組比較,均P0.05,n=5)。3.PKCα阻斷劑G(?)6983(0.5μmol/L)明顯的減緩沒食子酸促進ANP分泌的效應(yīng),并可完全翻轉(zhuǎn)沒食子酸對心房機械活動的作用(與對照循環(huán)比較,均P0.05,n=6)。4.PKCδ的阻斷劑Rottlerin(1.0μmol/L)對沒食子酸促進ANP的分泌和心房肌發(fā)揮正性肌力作用未產(chǎn)生顯著影響(與對照循環(huán)比較,均P0.05,n=6)。5.PLC的阻斷劑U73122(3.0 μmol/L)不僅完全阻斷沒食子酸上調(diào)PKCβ和PKCε蛋白表達的作用(與GA組比較,P0.05,n=6),而且也完全解除沒食子酸促進ANP分泌的效應(yīng),并翻轉(zhuǎn)沒食子酸對心房肌的正性肌力作用(與對照循環(huán)比較,均 P0.05,n=6)。6.Ca~(2+)/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II的阻斷劑KN62(3.0μmol/L)反而強化沒食子酸增加ANP分泌的效應(yīng),并翻轉(zhuǎn)沒食子酸對心房的正性肌力作用(與對照循環(huán)比較,均P0.05,n=6)。結(jié)論:沒食子酸通過PLC-DAG-PKC和PLC-IP3-Ca2+信號轉(zhuǎn)導途徑促進大鼠ANP分泌,同時對心房肌發(fā)揮正性肌力作用。
【圖文】：

維持心房搏動。逡逑心房搏動壓的變化（倍數(shù)）＝（給藥后的搏動壓水平－基礎(chǔ)搏動壓水平）／逡逑基礎(chǔ)搏動壓水平。逡逑利用手術(shù)線將心房固定在透明聚乙烯套管的一端后，將套管置于逡逑２．０ｃｍ＞＜４．Ｏｃｍ的玻璃培養(yǎng)皿中，，并且心房組織沒于培養(yǎng)皿底部體積為３ｍｌ的逡逑ＨＥＰＥＳ緩沖液中，確保心房組織不貼壁后，立即連接恒速蠕動栗向心房腔內(nèi)持逡逑續(xù)灌注氧飽和的ＨＥＰＥＳ緩沖液，裝置另一端會有心房灌流液流出。培養(yǎng)皿與恒逡逑溫水浴箱連接，使大鼠心房的溫度維持在３７°Ｃ左右，與在體所需溫度保持一致。逡逑給予心房３５Ｖ、１．５Ｈｚ的連續(xù)單刺激以維持心房搏動。經(jīng)過６０ｍｉｎ的穩(wěn)定期之后，逡逑方可正式開始實驗，每１２ｍｉｎ設(shè)定為一個循環(huán)，每２ｍｉｎ收集一次心房灌流液以逡逑用于測定ＡＮＰ含量的變化。逡逑

磁力攪拌器充分混勻。轉(zhuǎn)膜前至少３０ｍｉｎ用預冷的轉(zhuǎn)膜液浸泡轉(zhuǎn)膜濾紙和，每塊膠使用兩塊海綿、六片薄濾紙或兩片厚濾紙。剪好與膠體大小相同的逡逑ＤＦ膜，轉(zhuǎn)膜前５ｍｉｎ將其浸泡于預冷過的甲醇溶液中，使ＰＶＤＦ膜上的電荷逡逑分活化，提高轉(zhuǎn)膜效率。逡逑轉(zhuǎn)膜：由下至上將黑夾板（陰極）、海綿墊、３層濾紙、凝膠、ＰＶＤＦ膜、３逡逑濾紙、海綿墊、白夾板（陽極）按順序依次擺好，為了確�！叭�明治”緊密貼合，逡逑膠與ＰＶＤＦ膜必須對齊。另外，每放一層都應(yīng)排盡氣泡，如果有氣泡，可用光逡逑的試管在表面輕輕滾動，以排除氣泡。“三明治”轉(zhuǎn)膜如圖３所示。逡逑按裝置電極正確連接好裝置，接通電源，確保電荷由負極向正極流動，置Ｃ冰箱后，選用低電壓９０Ｖ恒壓轉(zhuǎn)膜大約３０－６０ｍｉｍ轉(zhuǎn)膜時間需依據(jù)凝膠的厚逡逑和目標蛋白的大小而定，目標蛋白分子量越大，所需轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則轉(zhuǎn)逡逑時間越短。逡逑轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，打開轉(zhuǎn)膜夾板，小心取出ＰＶＤＦ膜并做好標記。逡逑＜邋７邋Ｖ邋７１—（＂邋：■邋（＂＞邋ｆ邋ｙ￣７邋Ｔ邋７１邋Ｃ邋｝邋…廠邋ｙｎ邋ｎ邋廠）灸邐逡逑
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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