發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 21:32

　　 在真核細(xì)胞中,自噬(autophagy)對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、脅迫響應(yīng)和免疫病原物侵染具有重要作用。研究表明,宿主細(xì)胞利用自噬途徑將入侵病毒運(yùn)送至溶酶體降解,而病毒則借助該途徑促進(jìn)自身復(fù)制。目前,自噬在病毒侵染中的作用受到廣泛關(guān)注。桿狀病毒是昆蟲的重要病原物,然而,關(guān)于昆蟲自噬途徑與桿狀病毒侵染的關(guān)系并不清楚。在本文中,采用比較基因組學(xué)方法,我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)(40多個(gè))自噬相關(guān)基因高度保守地存在于酵母、人類和已測序的昆蟲基因組中。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),我們檢測了苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)感染粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細(xì)胞Tnms42和草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞Sf9不同時(shí)間40個(gè)自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化,結(jié)果顯示:,幾乎所有自噬相關(guān)基因的表達(dá)在病毒感染后1~6小時(shí)之間都有不同程度的變化,而在病毒感染后12~48小時(shí)則持續(xù)降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在AcMNPV感染的Tnms42與Sf9細(xì)胞中大多數(shù)自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢相同,其中轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)的基因?yàn)?4~22個(gè),而表達(dá)水平明顯下調(diào)的基因在兩種細(xì)胞系中分別為13和11個(gè)。為了檢測AcMNPV感染后Sf9細(xì)胞中自噬體的形成,我們構(gòu)建了GFP標(biāo)簽的ATG8重組表達(dá)質(zhì)粒GFP-SfATG8pBlue。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-SfATG8pBlue結(jié)合AcMNPV感染的結(jié)果表明,在病毒感染后36~48小時(shí)GFP-ATG8的熒光斑點(diǎn)數(shù)顯著增加。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),在病毒感染后36和48小時(shí)出現(xiàn)明顯的ATG8-PE條帶,揭示在AcMNPV侵染較晚時(shí)期顯著誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生了自噬。最后,通過RNA干擾下調(diào)ATG14與ATG101表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)抑制這兩個(gè)宿主細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá)顯著升高了AcMNPV極早期基因ie1啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因LacZ的表達(dá),但并未影響AcMNPV晚期基因p6.9啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因GUS的表達(dá),暗示ATG14與ATG101與AcMNPV出芽型病毒的入侵有關(guān)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S476.13
【部分圖文】：

昆蟲自噬途徑與桿狀病毒 AcMNPV 侵染關(guān)系初探養(yǎng)充足的條件下，自噬途徑也會(huì)對(duì)一些特殊的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性的性自噬可以對(duì)細(xì)胞器或某些蛋白質(zhì)的完整性和數(shù)量進(jìn)行調(diào)節(jié)，這對(duì)于細(xì)胞在環(huán)境和脅迫條件下的穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要。一般情況下，選擇性自噬始于待降的泛素化，之后自噬的貨物結(jié)合蛋白識(shí)別這些泛素化的細(xì)胞器并使其直接或自噬相關(guān)蛋白互作形成自噬體膜。盡管細(xì)胞器清除的自噬機(jī)制與非選擇性自大致相同，但參與不同細(xì)胞器的選擇性自噬的相關(guān)分子卻有著一定的特異性擇性自噬主要包括線粒體自噬（Mitophagy）、過氧化物酶體自噬（Pexopha體自噬（Lysophagy）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬（Reticulophagy）、細(xì)胞核自噬（Nucleopha自噬（Xenophagy）、脂類自噬（Lipophagy）和核糖體自噬（Ribophagy）（A，2017）。當(dāng)前研究已經(jīng)證實(shí)選擇性自噬與神經(jīng)退行（Nixon，2013）、衰老（No，2013）和腎臟損傷（Maejima et al.，2013）等多種生理變化有關(guān)。

2000），之后與 ATG7 結(jié)合并被轉(zhuǎn)運(yùn)至 ATG（3類 E2 結(jié)合酶（）Tanida et al.，2004）。最后，ATG16L復(fù)合物（類E3連接酶）使LC3 與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）共價(jià)結(jié)合形成 LC3-Ⅱ（或 ATG8-PE）完成 LC3 的脂化（Mizushima et al.，1998）。LC3-Ⅱ錨定于游離的自噬膜并介導(dǎo)這些不同來源的自噬膜互相融合延伸，形成完整的自噬體（Nakatogawa et al.，2007）。在自噬的最后階段即自噬體成熟階段，RAB7 和可溶性 N-乙基馬來酰亞胺敏感因子結(jié)合蛋白受體（SNARE）蛋白家族的 STX17 修飾自噬體并介導(dǎo)自噬體與溶酶體的融合，最終完成對(duì)自噬底物的降解（Itakura et al.，2012）。Beclin 1-PI3KC3 復(fù)合物亞基 ATG14L 直接與 STX17 結(jié)合增加 STX17-SNAP29 復(fù)合物穩(wěn)定性，之后 SNAP29 與定位于溶酶體的 VAMP8 互作促進(jìn)了溶酶體與自噬體的融合（Diao et al.，2015）。PLEKHM1 作為接頭蛋白與 LC3、RAB7 和 STX17 結(jié)合并招募 HOPS 復(fù)合物使自噬體與溶酶體進(jìn)一步接觸（McEwan et al.，2015）。在這一過程中，Beclin 1-PI3KC3 復(fù)合物中的 ATG14L 亞基被 UVRAG 替換（Itakura et al.，2008）。

8昆蟲自噬途徑與桿狀病毒 AcMNPV 侵染關(guān)系初探因子TRIM5α可以介導(dǎo)自噬激活復(fù)合物的組裝促進(jìn)自噬對(duì)HIV-1的降解（Ribeiro et al.，2016）。自噬還可以在不依賴降解過程的情況下幫助細(xì)胞抑制病毒的復(fù)制。諾如病毒（NoV）可引起一種人類可傳染的非細(xì)菌性腸胃炎（Baldridge et al.，2016）。在鼠類諾如病毒（MNV）感染小鼠的實(shí)驗(yàn)中，干擾素 IFNγ 介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)需要主要功能為形成自噬體的 ATG5-ATG12-ATG16L1 蛋白復(fù)合物的參與（Hwang et al.，2012）。然而，在該抗病毒反應(yīng)中并不需要自噬體和溶酶體融合降解病毒，而是利用 LC3 將 IFNγ誘導(dǎo)的 GTP 酶運(yùn)送到 MNV 復(fù)制復(fù)合物抑制病毒復(fù)制（Biering et al.，2017）。
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