發(fā)布時間：2020-06-17 22:15

【摘要】：水稻開花期決定著水稻品種的地域分布、適應性以及產量的潛能。穗型和粒形直接決定著水稻產量三要素中的每穗粒數和千粒重。對水稻開花期、穗型和粒形的調控基因進行功能解析,挖掘更多優(yōu)異的等位基因,有助于水稻的定向遺傳改良和分子設計育種。在30個水稻Dof基因成員中只有3個基因被證實參與抽穗期的調控。為了進一步挖掘Dof家族基因是否存在更多的抽穗期基因以及優(yōu)異的基因資源,本研究的第一部分主要圍繞水稻Dof家族基因的功能展開。粒形直接決定著千粒重,繼而影響水稻產量。本研究的第二部分圍繞一個水稻粒形基因WG7的功能展開的。主要研究結果如下:1.利用529份水稻種質資源的抽穗期數據,結合RiceVarMap網站上的基因型數據,對30個水稻Dof家族基因進行單倍型水平上的關聯分析,共有22個Dof基因與抽穗期相關。這22個Dof基因分為三種類型。第一種類型有8個Dof基因(OsDof6,7,10,11,13,16,20和21),它們在長日照和短日照條件下,秈稻亞群和粳稻亞群單倍型之間都存在抽穗期的顯著性差異。第二種類型包括OsDof1和OsDof12,在長日照條件下,秈稻亞群和粳稻亞群單倍型之間都存在抽穗期的顯著性差異。但在短日照條件下,無論是秈稻還是粳稻單倍型之間都不存在顯著性的差異。第三種類型有4個Dof基因(OsDof23,25,29和30),它們無論在長日照還是在短日照條件下,只有粳稻亞群單倍型之間存在抽穗期的顯著性差異,而在秈稻亞群單倍型之間不存在顯著性差異。剩余的8個Dof基因單倍型之間沒有顯著性的差異。2.利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對30個Dof基因進行功能驗證,發(fā)現11個基因和9個基因的CRISPR/Cas9突變體分別在長日照條件和短日照條件下有抽穗期的效應。Dof家族的其他成員沒有抽穗期的效應。此外,Dof家族部分基因的突變體對株高也有影響。3.核酸多樣性分析顯示有6個基因π_c/π_w比值都小于0.5,表明它們在馴化和遺傳改良過程中經歷了選擇。在這6個基因中,OsDof2,16和24這3個基因調控抽穗期。OsDof7和OsDof21的Tajima’s D值在野生稻中是負數(P0.05),表明OsDof7和OsDof21已經在野生稻中經歷了純化選擇。此外,8個Dof基因(OsDof5,8,12,14,17,18,22和29)在栽培稻中以及3個Dof基因(OsDof3,5和7)在野生稻中的Fu and Li’s D值顯著偏離中性(P0.05),表明這些基因在野生稻中經歷了自然選擇,并在栽培稻中經歷了人工選擇。4.與野生型中花11相比,OsDof15的CRISPR/Cas9突變體顯著變小,特別是株高和穗型。OsDof15啟動子的T-DNA插入突變體植株較小,穗長較短,因此我們將該基因命名為SP3(Short Panicle 3)。轉基因互補以及CRISPR/Cas9敲除實驗,進一步證實SP3就是OsDof15。5.實時定量PCR和RNA原位雜交實驗顯示SP3特異地在幼穗中表達,尤其是在枝梗原基中(包括一次枝梗和二次枝梗原基)表達量最高。亞細胞定位結果顯示SP3是核蛋白,雙熒光素酶轉錄活性實驗證明SP3是一個轉錄激活子。實時定量PCR和RNA原位雜交實驗證明SP3可以調控APO2/RFL的表達。6.細胞分裂素生物合成和降解相關基因分別在sp3突變體中的表達下調和上調最終導致sp3突變體內源細胞分裂素含量的減少。7.我們發(fā)現一個T-DNA插入突變體,植株變小,粒形變窄,命名為wg7(wide grain 7)。測序結果顯示,T-DNA插入到LOC_Os07g47360基因的第7個外顯子中�；�因型分析結果顯示T-DNA插入與粒寬共分離,通過超表達以及CRISPR/Cas9敲除實驗,證實了WG7就是LOC_Os07g47360。8.穎殼切片以及電鏡掃描結果顯示細胞數目的差異是造成粒寬差異的主要原因,細胞周期相關基因的表達量在wg7突變體和野生型之間也有顯著性差異。9.利用酵母單雜交以及凝膠阻滯實驗找到了WG7結合的核心順式元件CATTTC,證實了OsMADS1是WG7的直接下游靶標基因。雙熒光素酶轉錄活性實驗證明了WG7通過直接結合到OsMADS1啟動子上的CATTTC元件上,激活OsMADS1的表達。對WG7結合的核心順式元件CATTTC的CRISPR/Cas9敲除證實了這種調控關系的真實性。10.WG7編碼一個含有CW結構域的鋅指蛋白,染色質免疫共沉淀和實時定量PCR結果顯示,在wg7突變體中,OsMADS1啟動子區(qū)域的組蛋白H3K4me3的含量顯著低于野生型。這些結果表明,WG7通過介導OsMADS1啟動子H3K4me3的修飾來調控OsMADS1的表達。
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S511
【圖文】：

軸和小穗軸組成，小穗軸又由花梗和一次、二次甚至三次枝梗組成（圖 1-1A）形成和發(fā)育要經過一系列分生組織的轉變和過渡，每一個分生組織轉變過渡都關重要的。營養(yǎng)生長向生殖生長過渡的標志是頂端分生組織（ShootapicalmeriM）向穗分生組織（Inflorescencemeristem，IM）的轉變。IM 具有枝梗分生組Branchmeristem，BM）的活性，IM 在產生適當數目的一次枝梗分生組織（Primnchmeristem，PBM）后則不再繼續(xù)發(fā)育而形成退化點(Degeneratepoint，DP)失性。每一個 PBM 上，除了形成數量不同的二次枝梗分生組織(Secondary brristem，SBM)外，還會在一次枝梗上部繼續(xù)分化形成側生小穗分生組織(Laikeletmeristem，LSM)，LSM 具有側生花序結構(Lateralspikelet，LS)的特性。枝生組織形成之后，小穗分生組織(Spikeletmeristem，SM)才得以形成；PBM 的最將分化成終端小穗分生組織(terminal spikelet meristem，TSM)。而著生于 PBM SBM 也進一步的向 SM 進行轉變。隨后，退化穎片、空穎、外稃、內稃、以及和雌蕊原基相繼在小穗中產生（圖 1-1B）。

水稻 Dof 家族基因和粒形基因 WG7 的功能研究3 結果與分析3.1 Dof 家族基因的基因結構利用已報道的 OsDof12 基因保守的 Dof 結構域的氨基酸序列檢索 RGAP 數據庫和 NCBI 數據庫，共檢索到 30 個水稻 Dof 基因。這 30 個 Dof 基因在基因組中的分布是不均勻的，第 1 和第 3 染色體各自具有最多數量的基因（6 個），第 11 染色體上沒有 Dof 基因（表 1-2）。通常，Dof 家族基因具有相對簡單的結構。在所有的 Dof基因中，17 個基因（56.7％），12 個基因（40％）和 1 個基因（3.3％）分別沒有內含子，一個內含子和兩個內含子（圖 1-2）。

本文編號：2718240