發(fā)布時(shí)間：2020-11-03 23:28

　　 豆科植物不僅種類繁多而且分布廣泛,由于絕大多數(shù)豆科植物可以與土壤中的根瘤菌形成互利共生的關(guān)系,并且通過共生固氮滿足自身對(duì)于氮素營(yíng)養(yǎng)的大部分需求。Sinorhizobium fredii Q8菌株是從陜西省楊凌區(qū)農(nóng)田土壤中分離得到的一株根瘤菌,與西北地區(qū)廣泛種植的大豆中黃13品種具有優(yōu)良的結(jié)瘤和固氮性能。本文以S.fredii Q8以及大豆中黃13品種為主要研究材料,通過轉(zhuǎn)錄組、基因敲除及互補(bǔ),結(jié)合熒光探針觀察等方法研究H_2S信號(hào)分子及其代謝酶在S.fredii Q8與大豆植株結(jié)瘤和固氮過程中的作用及其發(fā)揮作用的機(jī)制。首先,使用NaHS作為外源H_2S供體處理大豆植株后,植株根部以及根瘤內(nèi)的H_2S含量有了較為明顯的增加。同時(shí)在接種根瘤菌S.fredii Q8之后,大豆植株在經(jīng)過NaHS處理之后植株的長(zhǎng)勢(shì)有了顯著的提高,根長(zhǎng)、株高、地上部分以及根部的干重都有了顯著增加。光合作用速率以及葉綠素?zé)晒鈪��?shù)的測(cè)量表明,經(jīng)過NaHS處理的植株葉片中,葉綠素含量以及凈光合速率都高于對(duì)照組植株。在共生能力方面,經(jīng)過外源H_2S處理的大豆植株的結(jié)瘤數(shù)量也顯著高于對(duì)照組植株。不僅如此,外源H_2S處理還促進(jìn)了大豆根瘤的固氮能力,固氮酶活性測(cè)定結(jié)果顯示經(jīng)過NaHS處理的大豆植株所結(jié)根瘤內(nèi)部的固氮酶活性要顯著高于未處理的對(duì)照組根瘤。而qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),外源H_2S處理可以促進(jìn)共生相關(guān)基因如根瘤菌nodA、nodC、nodD以及大豆根部GmENOD40、GmERN、GmNSP2b、GmNIN1a/2a/2b的表達(dá)。此外,與氮代謝相關(guān)的GmGOGAT、GmAS、GmNiR、GmSAT1、GmLb等基因的表達(dá)量也在經(jīng)過NaHS處理的植株根部有所上調(diào)。這些結(jié)果說明外源H_2S處理可以促進(jìn)S.fredii Q8與大豆植株的共生與結(jié)瘤,并且對(duì)大豆根瘤的固氮能力具有促進(jìn)作用。由于固氮作用的提升,大豆植株的氮素供應(yīng)較為充足,這也促進(jìn)了葉綠素的合成以及光合作用的進(jìn)行,從而提高了大豆植株的碳同化能力,最終使得大豆植株的長(zhǎng)勢(shì)得到促進(jìn)。其次,通過H_2S特異性熒光探針觀察后發(fā)現(xiàn),在大豆根瘤的固氮區(qū)有大量?jī)?nèi)源H_2S產(chǎn)生。將S.fredii Q8編碼cystathionineγ-lyase(CSE)的CSE基因敲除之后,?CSE突變體根瘤菌內(nèi)源H_2S的產(chǎn)量顯著降低,并且用?CSE菌株接種大豆植株形成的根瘤內(nèi)部H_2S的產(chǎn)生也受到了明顯的抑制。在接種?CSE菌株的大豆根瘤中,不僅內(nèi)源H_2S含量較低,固氮酶活性也顯著低于接種野生型菌株WT以及互補(bǔ)菌株Cp?CSE所形成的根瘤。透射電鏡的觀察發(fā)現(xiàn),雖然?CSE根瘤的外部形態(tài)和大小與WT菌株所結(jié)根瘤沒有顯著差異,但是固氮區(qū)根瘤細(xì)胞內(nèi)類菌體以及共生體膜的形態(tài)都發(fā)生了與氧化脅迫條件下相似的變化。不僅如此,內(nèi)源H_2S的不足還會(huì)導(dǎo)致根瘤中過氧化氫等活性氧分子(ROS)的積累和氧化損傷的出現(xiàn)。與此同時(shí),H_2S含量降低也促進(jìn)編碼抗氧化酶基因的表達(dá)以及酶活性的增加。這些結(jié)果說明,大豆根瘤的內(nèi)源H_2S可以通過其抗氧化作用維持大豆根瘤內(nèi)的固氮酶活性,促進(jìn)大豆的共生固氮作用。最后,根瘤菌的3-mercaptopyruvate sulfurtransferase(3MST)對(duì)于S.fredii Q8對(duì)大豆中黃13品種的侵染能力也具有很顯著的影響。將編碼3MST的sseA基因敲除之后,?3MST菌株與大豆中黃13植株共生所形成的根瘤雖然數(shù)量明顯增加,但都是豆血紅蛋白含量極低而且?guī)缀鯖]有固氮能力的無效根瘤。石蠟切片和透射電鏡觀察根瘤的顯微結(jié)構(gòu)以及超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),?3MST菌株在根瘤細(xì)胞內(nèi)的侵染和定殖能力受到了破壞,類菌體數(shù)量極少而且形態(tài)出現(xiàn)了明顯的畸形。同時(shí),3MST的缺失還會(huì)抑制S.fredii Q8 III型分泌系統(tǒng)與結(jié)瘤相關(guān)的效應(yīng)蛋白NopX的分泌。通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),在接種?3MST菌株后1h與3h內(nèi)差異表達(dá)基因較多。通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),接種?3MST菌株與接種WT菌株對(duì)植物的與病原物互作通路中的基因的表達(dá)影響最為顯著。通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在接種WT菌株后1 h,大豆植株根部的與病原物相關(guān)的防御基因的表達(dá)會(huì)被抑制,而在接種?3MST菌株的大豆中,這些與病原物防御反應(yīng)相關(guān)的基因的表達(dá)不僅沒有受到明顯的抑制,少數(shù)防御基因的表達(dá)量還會(huì)出現(xiàn)上調(diào)的情況。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S565.1
【部分圖文】：

根瘤的類型是由豆科宿主本身所決定的。定型根層細(xì)胞起始分裂的位置、根瘤內(nèi)分生組織的存在nd Gresshoff, 1988; Newcomb et al., 1979)。不定細(xì)胞，隨后中柱鞘以及皮層外層的細(xì)胞才開始定型根瘤中會(huì)一直存在分生區(qū)，可以不斷分裂產(chǎn)導(dǎo)致了不定型根瘤的性狀通常為棒狀(Bond, 1al., 1979)。成熟之后的不定型根瘤，由于分生組在根瘤內(nèi)部產(chǎn)生四個(gè)不同的分區(qū)：分生區(qū)、侵染瘤中的維管束的分支相比于定型根瘤也相對(duì)較分生組織，根瘤的外形為圓形，內(nèi)部也沒有形成n and Bauer, 1982)。初始的細(xì)胞分裂位置在接近l., 2010)。成熟之后的定型根瘤內(nèi)部的侵染細(xì)胞以育和衰老，這也就導(dǎo)致了定型根瘤的壽命只有短有新的根瘤產(chǎn)生來代替衰老的根瘤(B G Rolfe的產(chǎn)生過程示意圖見圖 1-1.

為與調(diào)控結(jié)瘤數(shù)量有關(guān)。比如 LjKLAVIER 基因就可以調(diào)節(jié)百脈根的結(jié)a-Kira E, 2010)。LjASTRAY 基因通常被認(rèn)為與百脈根植株的光調(diào)節(jié)有關(guān)imura R (2002)發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因在缺失突變之后，百脈根植株的結(jié)瘤數(shù)也會(huì)增truncatula 中，MtEFD 是 MtERF 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，當(dāng) MtEFD 基因發(fā)生突變植株會(huì)表現(xiàn)出結(jié)瘤數(shù)增加的性狀(Vernie et al., 2008)。這些基因?qū)τ诮Y(jié)瘤數(shù)定的負(fù)調(diào)節(jié)作用，但是其作用機(jī)制是直接參與 AON 途徑或者通過其他途徑數(shù)量尚不清楚。乙烯作為一種植物激素，不僅可以促進(jìn)果實(shí)的成熟和花的衰老(G H Kraus, 2003),還可以在豆科植物中控制結(jié)瘤的數(shù)量(Ferguson and Mathesius, 2003;Geil, 2002)。在遭遇逆境脅迫條件下，植株自身往往會(huì)產(chǎn)生大量的乙烯，這通過降低結(jié)瘤的數(shù)量來避免植物在不利的生長(zhǎng)環(huán)境中將過多的能量和碳源進(jìn)行共生固氮。當(dāng)植物的乙烯受體發(fā)生功能的缺失時(shí)植株會(huì)出現(xiàn)結(jié)瘤數(shù)量。比如當(dāng)百脈根的乙烯受體 LjETR1 和 LjEIN2 被敲除之后，突變體的結(jié)瘤(Lohar et al., 2009)。當(dāng)蒺藜苜蓿的乙烯受體 MtEIN2 基因發(fā)生突變后，突變同樣出現(xiàn)了增加的現(xiàn)象(Varma Penmetsa et al., 2008)。

氫（H2S）信號(hào)在植物中的研究進(jìn)展氨基酸如半胱氨酸和蛋氨酸的重要組成成分，以及輔因子、多的重要元素，對(duì)所有生物都是必不可少的。植物作為同化者，同化方式將氧化硫酸鹽形式的無機(jī)硫還原成有機(jī)態(tài)的硫供自kahashi et al., 2010)。因此，植物利用硫的第一步是通過硫酸鹽鹽。一旦進(jìn)入表皮，絕大多數(shù)的硫酸鹽會(huì)通過細(xì)胞間的胞間連管束中向外運(yùn)輸以避免硫酸鹽的積累，也會(huì)有部分的硫酸鹽透。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，硫酸鹽或者儲(chǔ)存在細(xì)胞的液泡中，或者Takahashi, 2015; Takahashi et al., 2010)。利用 ATP 水解釋放的能活化形成腺苷 5 -磷酸硫酸鹽（APS）。該反應(yīng)由 ATP 硫�；�物中，所形成的的 APS 可以通過 APS 還原酶（APR）直接被硫酸鹽進(jìn)一步被氧還蛋白依賴型的亞硫酸鹽還原酶（SiR）還被合稱為乙酰絲氨酸（OAS）并最終參與半胱氨酸的合成。這酸鹽通過還原同化進(jìn)入植物初級(jí)代謝的途徑，見圖（1-3）。

本文編號(hào)：2869255