發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 10:52

　　 前人研究表明擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtTT8作為bHLH(basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一,不僅參與花青素和原花青素的生物合成,而且影響種子的發(fā)育和儲(chǔ)藏物質(zhì)的積累。為研究甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)中同源基因BnTT8是否具有類似的功能,我們從甘藍(lán)型油菜品種秦優(yōu)7號(hào)中克隆得到了BnTT8的CDS序列,對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和煙草葉片亞細(xì)胞定位,并檢測(cè)了BnTT8在油菜不同組織中的時(shí)空表達(dá)模式。此外,我們將構(gòu)建的過(guò)表達(dá)植物載體35S:BnTT8轉(zhuǎn)化擬南芥突變體tt8-4,并成功獲得了tt8-4 35S:BnTT8的T3代轉(zhuǎn)基因植株并分析比較了BnTT8對(duì)多個(gè)生物學(xué)過(guò)程的作用,如花青素和原花青素的合成,種子儲(chǔ)藏物質(zhì)的積累,以及對(duì)高鹽、高糖脅迫的響應(yīng)等。在此基礎(chǔ)之上,我們將構(gòu)建的BnTT8-RNAi(RNA interference)載體轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜自交品系L111,以期獲得轉(zhuǎn)基因油菜植株。本試驗(yàn)的主要結(jié)果如下:1.從甘藍(lán)型油菜品種秦優(yōu)7號(hào)中克隆到BnTT8基因,將其蛋白序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的甘藍(lán)型油菜BnTT8和擬南芥AtTT8蛋白序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,油菜BnTT8和擬南芥AtTT8的蛋白序列相似度非常高,且功能結(jié)構(gòu)域高度保守,表明BnTT8與AtTT8可能具有相似的生理生化功能。2.煙草葉片亞細(xì)胞定位結(jié)果表明BnTT8位于細(xì)胞核內(nèi),可推測(cè)BnTT8可能與AtTT8一樣作為轉(zhuǎn)錄因子起調(diào)控作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示BnTT8在油菜的不同組織中都有表達(dá),且在發(fā)育的種子中表達(dá)量最高,這表明該基因可能在植株生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程(尤其是種子發(fā)育)中發(fā)揮作用。3.將構(gòu)建好的重組載體35S:BnTT8轉(zhuǎn)入擬南芥突變體tt8-4植株中,對(duì)獲得的純合植株進(jìn)行PCR鑒定,在DNA和RNA的水平上都證實(shí)我們已成功得到了tt8-4 35S:BnTT8的轉(zhuǎn)基因植株。4.對(duì)野生型、突變體tt8-4以及純合轉(zhuǎn)基因植株tt8-4 35S:BnTT8的種子性狀進(jìn)行分析,結(jié)果表明在突變體基礎(chǔ)上過(guò)量表達(dá)BnTT8能夠?qū)⑼蛔凅wtt8-4的種皮顏色、種子高脂肪酸和低儲(chǔ)藏蛋白的表型恢復(fù)至野生型水平。5.在濃度為100mM氯化鈉和3%(w/v)葡萄糖的脅迫下,轉(zhuǎn)基因植株tt8-435S:BnTT8可以將突變體tt8-4種子萌發(fā)遲緩和幼苗生長(zhǎng)受損的狀況恢復(fù)至野生型水平,表明BnTT8與AtTT8功能類似,參與調(diào)控種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成。6.脅迫響應(yīng)基因表達(dá)分析結(jié)果顯示,在無(wú)任何脅迫處理的條件下,野生型和突變體中除了AtABA1、AtNCED3和At RAB18的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平存在明顯差異外,其它基因的表達(dá)水平差異不明顯;在高鹽和高糖脅迫下,AtABI2、AtCBL1、AtCBL9、AtNCED3、AtRD29A、AtRD22以及AtKINI在突變體和野生型中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在顯著差異,轉(zhuǎn)基因植株tt8-4 35S:BnTT8可以將突變體中上述基因的表達(dá)恢復(fù)至野生型水平,表明BnTT8可能參與調(diào)控了脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。7.利用油菜轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲取BnTT8-RNAi的油菜轉(zhuǎn)基因植株,初步鑒定結(jié)果顯示我們獲得了轉(zhuǎn)基因油菜植株。本試驗(yàn)通過(guò)將甘藍(lán)型油菜BnTT8轉(zhuǎn)入到擬南芥突變體中進(jìn)行初步的功能驗(yàn)證。通過(guò)比較分析BnTT8和AtTT8在植株生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)生理過(guò)程中功能的異同,不僅為我們研究BnTT8在油菜自身中的調(diào)控作用奠定了必要的理論依據(jù),而且也為油菜品質(zhì)育種提供了關(guān)鍵的基因原件。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S565.4
【部分圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述 階.段。在這個(gè)階.段，合子（受精卵）首.先分.裂成基細(xì).胞和頂.細(xì)胞，著，頂細(xì).胞和基.細(xì)胞會(huì)分.裂成球.形和柄，在珠.孔處結(jié).合形成球.狀胚，胚.體因變成.心形而被稱.為心.型胚，此時(shí)子.葉和胚.根原基已.經(jīng)出.現(xiàn).胎發(fā)育.階段的.完成。胚進(jìn).入成.熟期后，先.后經(jīng)歷魚.雷型.胚、線.性胚育成.成.熟胚。在這.個(gè)階段，胚會(huì)進(jìn)一步伸.長(zhǎng)并分.化出胚.根、胚芽和胚..續(xù)發(fā).育，在成.熟胚時(shí).期發(fā)生彎.曲并充滿.整個(gè)種.胚。最終，珠被發(fā).育成.粉層存.在于種皮和.胚之間。從圖 1-1 中可以看出，在種.子發(fā)育初.期隨著種.子的不.斷生長(zhǎng)，子葉和胚.根迅速擴(kuò).大伸長(zhǎng)并折疊.彎.曲，最終使成為種子儲(chǔ).藏物質(zhì)的主.要場(chǎng)所。

型和油脂分布圖( Borisjuk et al., 2013)。(A)早期發(fā)的胚；(D)成熟階段的胚；(E)-(H)分別對(duì)應(yīng)的是(A同積累量(umol/g)。d.el and Lipid distr.ibution map of rape see.d embryo. (; (B) the mid sto.rage stage; (C) the l.ate storage sta.ge; vi.rtual section shown in (E) to (H) , in which the lip.idrent color sc.ales (umol/g).程中，除了種子油脂的含量發(fā)生了變化外，淀的變化（圖 1-3）。在種子發(fā)育早期，種內(nèi)各也開始增加并以淀粉的形式儲(chǔ)藏在種皮或胚分解(圖 B-G)，到種子發(fā)育成熟階段，種皮和完全不顯色。而種子中的儲(chǔ)藏蛋白，其主要存油脂積累過(guò)程相似（圖 A 和 N）。通過(guò)蛋白發(fā)育前期和中期，儲(chǔ)藏蛋白的含量較少(圖 H

程油脂、淀粉和儲(chǔ)藏蛋白變化及分布( Borisjuk et al.B)-(F)種子中淀.粉變化示.意圖(碘液染色法)；(G)淀.粉積.累變化示.意圖(免疫共沉淀)；(N)儲(chǔ)藏蛋.白(包括油distributions of lipids, starches and proteins in the devatic represe.ntation of oleosin dis.tribution; (B) to (Ftic represen.tation of s.tarch distrb.ution; (H) to (chematic representation of cruciferin distribution.確了油菜種子的發(fā)育和油脂積累的過(guò)程，但是還尚不清楚。同屬十字花科的擬南芥與油菜親, 2006; Osborn et al., 1997)，且近些年來(lái)科研工機(jī)理研究的也比較深入，因此我們可以借助擬的功能，從而為研究油菜種子油脂積累的分
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2876315