發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 08:46

　　 黃金芽是一種光敏型黃化茶樹品種,新梢色澤受光調(diào)控,自然弱光下芽葉呈綠色,光強(qiáng)在200～270μmol photons·m~(-2)·s~(-1)時(shí)開始黃化,且隨光強(qiáng)增加,黃化程度逐漸加深,并出現(xiàn)葉片灼傷等生理脅迫現(xiàn)象。黃金芽新梢色澤隨自然光強(qiáng)變化的特性為光調(diào)控葉綠素代謝和光合作用的研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料,有利于探明光調(diào)控葉綠素代謝以及光合作用的具體路徑和方式,闡明其光響應(yīng)機(jī)制。為了消除過強(qiáng)光照帶來的逆境生理及代謝干擾,本研究前期采用遮蔭方法設(shè)置3種不同的自然光強(qiáng)處理黃金芽,獲得不同色澤新梢材料,通過測(cè)定其光合生理指標(biāo)(光合作用、葉綠素?zé)晒鈪��?shù)等)、逆境生理指標(biāo)(抗氧化酶活性、活性氧含量等)以及葉綠體膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)等,合理確定了適宜探究黃金芽黃化機(jī)理的黃化材料和對(duì)照材料;隨后,對(duì)上述2個(gè)材料進(jìn)行了代謝組和蛋白組學(xué)比較研究,同時(shí)分析了葉綠素、類胡蘿卜素代謝途徑關(guān)鍵酶和光合電子傳遞鏈組成蛋白以及暗反應(yīng)過程關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量,從多個(gè)維度探究了黃金芽新梢色澤對(duì)光響應(yīng)的分子機(jī)制;同時(shí),從黃金芽新梢中首次篩選并克隆了一個(gè)正響應(yīng)光強(qiáng)變化且高表達(dá)的CsHIPP26.1蛋白基因,并對(duì)其功能進(jìn)行了探究,其主要研究結(jié)果如下:(1)對(duì)黃金芽進(jìn)行自然光下不同遮蔭程度處理依次獲得嫩綠(180μmol photons·m~(-2)·s~(-1),編號(hào)Y+S)、黃(720μmol photons·m~(-2)·s~(-1),編號(hào)Y)和明黃(1620μmol photons·m~(-2)·s~(-1),編號(hào)Hs)3種色澤葉片,經(jīng)生理特性分析發(fā)現(xiàn),黃色葉片(Y)的O_2~-、H_2O_2含量、Fv/Fm值以及葉綠體膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與嫩綠葉片(Y+S)相近,兩者之間無顯著差異,均處于無逆境脅迫的生理狀態(tài),但兩者在光合生理特性上差異顯著;Y與明黃葉片(Hs)在ΦPSⅡ、qP、光合響應(yīng)曲線特征、光飽和點(diǎn)、光補(bǔ)償點(diǎn)等指標(biāo)上差異不顯著,具有相似的黃化葉片光合生理特性,但Hs處于逆境生理狀態(tài)。由此可見:Y既具有Hs的黃化生理特征,同時(shí)又處于與Y+S相似的無逆境脅迫生理狀態(tài),能夠很好地體現(xiàn)黃金芽品種的黃化遺傳生理特性,而Y+S作為葉色正常的對(duì)照材料,可與Y一起作為黃金芽茶樹光響應(yīng)分子機(jī)制研究的適宜材料。(2)黃化葉片中葉綠素含量低是由于葉綠素合成受阻和中間產(chǎn)物降解增強(qiáng)所致。黃化葉片葉綠素合成有兩個(gè)主要受阻點(diǎn),第一個(gè)受阻點(diǎn)位于糞卟啉III(COPP III)到原卟啉IX(PP IX),其合成部位由葉綠體基質(zhì)向類囊體膜過渡。推測(cè)類囊體膜結(jié)構(gòu)的異常是導(dǎo)致此階段合成受阻的主要原因;第二個(gè)受阻點(diǎn)位于原葉綠素酸酯(Pchlide)到葉綠素酸酯b(chlorophyllide b),原葉綠素酸酯氧化還原酶(POR)和葉綠素酸脂a氧化酶(CAO)蛋白及基因表達(dá)量的顯著下調(diào)是導(dǎo)致其合成受阻的原因。此外,黃化葉片中原葉綠素酸酯a降解相關(guān)的脫鎂葉綠酸加氧酶(ACD1)酶基因和蛋白顯著表達(dá)增加,進(jìn)一步導(dǎo)致葉綠素a和b合成量減少。黃化葉片的葉黃素循環(huán)顯著增強(qiáng),類黃酮合成途徑中間代謝物含量顯著增加。黃金芽強(qiáng)光下葉片呈現(xiàn)黃色是由于葉綠素含量顯著降低造成葉片失綠后類胡蘿卜素和類黃酮等物質(zhì)顏色的呈現(xiàn)。(3)電子傳遞效率下降增強(qiáng)了黃化葉片對(duì)光的敏感性。黃化葉片捕光色素天線蛋白、PSII光反應(yīng)中心的D1(PsbA)、D2(PsbD)和Cytb559(PsbE)復(fù)合體以及放氧復(fù)合體蛋白PsbO和PsbP的含量顯著下調(diào),降低了光能捕獲與利用、供體側(cè)電子的產(chǎn)生與傳遞效率,質(zhì)體醌庫(PQ和PQH_2)的下降以及PC蛋白的顯著性下調(diào)則進(jìn)一步降低了黃化葉片的PSII到PSI之間的光合電子傳遞效率,但光合作用的暗反應(yīng)過程并未受影響。(4)通過蛋白組鑒定到一個(gè)響應(yīng)光強(qiáng)且在黃金芽中高表達(dá)的蛋白——CsHIPP26.1,對(duì)其進(jìn)行功能探究發(fā)現(xiàn),CsHIPP26.1基因和蛋白的表達(dá)隨著光照強(qiáng)度的增加而增強(qiáng),并且過表達(dá)CsHIPP26.1基因的蘋果愈傷組織能夠顯著提高對(duì)強(qiáng)光脅迫的耐受性。通過酵母雙雜交篩庫發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能夠與CsHIPP26.1互作的CsPIF4蛋白,經(jīng)過BiFC和體外pull-down驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)CsPIF4能夠與CsHIPP26.1在細(xì)胞核內(nèi)互作。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S571.1
【部分圖文】：

圖 1 被子植物葉綠素合成途徑Fig. 1 Synthesis of chlorophyll in angiosperms表 2 葉綠素合成途徑相關(guān)酶及基因Table 2 Enzymes and genesrelated to chlorophyll biosynthesis pathway步驟Step酶Enzyme基因名稱Gene調(diào)控物質(zhì)Regulatory substance1 谷氨酰-tRNA 還原酶(glutamyl tRNA reductase) HemA原葉綠素酸酯；FLU蛋白；血紅素；光2谷 氨 酰 -1- 半 醛 轉(zhuǎn) 氨 酶 (glutamate 1-semialdehydeaminotransferase)HemL1HemL2光3 5-氨基酮戊酸脫水酶(5-aminolevulinate dehydratase) HemB4 膽色素原合酶脫氨酶(porphobilinogen deaminase) HemC5 尿卟啉原 III 合酶(uroporphyriongen III synthase) HemD6 尿卟啉原脫羧酸酶(uroporphyrinogen decarboxylase) HemE7糞 卟 啉 原 氧 化 脫 羧 酶 (coproporphyrinogen oxidativedecarboxylase)HemF8 原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase) HemG19鎂鰲合酶 D 亞基(Mg chelatase D subumit)鎂鰲合酶 H 亞基(Mg chelatase H subumit)鎂鰲合酶 I 亞基(Mg chelatase I subumit)ChlDChlHChlI晝夜節(jié)律；Mg2+、ATP濃度；GUN4 蛋白；ALA；亞基間的相互

綠素合成途徑的調(diào)控素合成途徑涉及到 15 種酶和 20 多個(gè)基因，每一步酶促反應(yīng)受到抑變，都有可能導(dǎo)致葉綠素的合成受阻，造成葉綠素缺失。5-氨基酮戊第 2 步）、鎂螯合酶催化反應(yīng)（第 9 步反應(yīng)）和葉綠素酸酯的合成主要控制點(diǎn)，直接影響葉綠素的合成。LA 合成的調(diào)控A 的合成是葉綠素合成途徑的起始點(diǎn)，ALA 的含量決定了葉綠素合的總量。ALA 的合成反應(yīng)從谷氨酰-tRNA 開始，由谷氨酰-tRNA-reductase，Glu-TR）催化形成 1-半醛-谷氨酸，1-半醛-谷氨酸是產(chǎn)物，隨后由 1-半醛-谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（GSA）催化形成 ALA(Ayumi 2009)。Glu-TR 和 GSA 兩種酶結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，從而阻止 1-半高 1-半醛-谷氨酸向 ALA 的轉(zhuǎn)化效率，谷氨酰-tRNA 還原酶（Gl氨酸轉(zhuǎn)氨酶（GSA）的活性直接影響 ALA 的合成。

催化 ATP 的酶活性對(duì)維持 ChlD 亞基的穩(wěn)定性具有重要作用 (Lak13)。之外，鎂螯合酶還參與了質(zhì)體信號(hào)的傳導(dǎo)，調(diào)控葉綠體發(fā)育相關(guān)核基的 ChlH 亞基可以通過質(zhì)體信號(hào)調(diào)節(jié)捕光色素復(fù)合物基因（LHC 基i 等, 2001)，ChlD 亞基還參與了調(diào)控位于細(xì)胞核內(nèi)的基因 LhcpII 鎂螯合酶 ChlD 和 ChlI 亞基的基因突變體 Chlorina-1 和 Chlorina-9 體發(fā)育遲緩，基粒堆疊少，類囊體膜發(fā)育不全，葉綠素合成量下降素合成過程的中間產(chǎn)物受到嚴(yán)格調(diào)控，具有復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，合成突變可能影響所編碼的酶翻譯或者翻譯后表達(dá)，并影響其它中間產(chǎn)水稻 ygl1 突變體的研究中發(fā)現(xiàn)，編碼葉綠素合酶基因的突變，導(dǎo)致編因 HEMA 的表達(dá)降低了約 40%，同時(shí)還使編碼葉綠素酸酯 a 加氧酶低 (Wu 等, 2007)，進(jìn)一步影響了葉綠素的生物合成。
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