發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 02:57

　　 植物受病原菌或水楊酸及其類似物誘導(dǎo),會產(chǎn)生具有廣譜抗性特征的系統(tǒng)獲得抗性。NPR1蛋白和WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物SAR過程關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)。在大麥和小麥等麥類作物中,可在注射丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)DC3000的相鄰區(qū)觀察到與模式植物SAR類似的“獲得抗性(Acquired Resistance,AR)”。然而,麥類作物AR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及NPR1基因的功能仍亟待明確。本研究主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:利用丁香假單胞菌DC3000誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生AR反應(yīng),在DC3000接種相鄰區(qū)可有效地增強(qiáng)小麥對葉銹菌(Puccinia triticina,Pt)高毒性小種THTT的抗性水平。利用丁香假單胞菌DC3000誘導(dǎo)大麥轉(zhuǎn)基因材料Ubi::wNPR1和Ubi::HvNPR1-Kd產(chǎn)生AR反應(yīng),以稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株Guy11為二次病原物侵染測定AR水平。結(jié)果表明,大麥轉(zhuǎn)基因材料Ubi::wNPR1表現(xiàn)出對稻瘟菌菌株Guy11的抗性水平顯著提高,而Ubi::HvNPR1-Kd材料中的AR被明顯抑制。進(jìn)一步利用RNA-seq技術(shù),測定了上述材料在AR過程中的差異表達(dá)基因。通過生物信息學(xué)分析,推測一些病程相關(guān)PR基因和BTH處理誘導(dǎo)的BCI基因在AR過程中受NPR1基因調(diào)控。利用熒光實(shí)時(shí)定量qRT-PCR技術(shù),對部分基因表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證。從全基因組水平分析了WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因家族的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)并克隆了10個(gè)差異表達(dá)WRKY基因。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)技術(shù),發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)WRKY基因,包括HvWRKY6、HvWRKY40和HvWRKY70可顯著增強(qiáng)小麥對葉銹菌的抗病水平。本研究初步構(gòu)建了NPR1基因在麥類作物AR過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò),明確了該生物學(xué)過程在作物抗病遺傳改良方面的應(yīng)用前景。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因及關(guān)鍵WRKY轉(zhuǎn)錄因子,將為提高小麥抗病水平提供新思路及創(chuàng)新性種質(zhì)資源。
【學(xué)位單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S512.1
【部分圖文】：

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位（畢業(yè)）論文3 結(jié)果與分析菌 DC3000 引起的 AR 反應(yīng)可增強(qiáng)小麥病材料“Thatcher”苗期第二葉葉尖注射丁香。以清水注射作為對照，注射 DC3000 后 48 h接種小麥葉銹菌毒性小種 THTT。于接種后 1占葉片面積的百分比，實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩次系統(tǒng)重復(fù)復(fù)，利用 SAS 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié) AR 反應(yīng)可顯著（***P < 0.0001）增強(qiáng)小清水對照孢子堆數(shù)量明顯減少（圖 1）。

NPR1 基因介導(dǎo)的麥類作物獲得抗性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究稻瘟菌菌株 Guy11，設(shè)置 6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。接種稻瘟菌 5 d 后測量病斑大小。結(jié)果圖 2 所示，在大麥野生型材料中可觀察到明顯的對稻瘟菌 Guy11 的 AR 反應(yīng)。而在水處理中，wNPR1-OE 轉(zhuǎn)基因材料相對于野生型材料對 Guy11 表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性平，證明在不需要丁香假單胞菌 DC3000 誘導(dǎo)下，wNPR1-OE 材料也可以增強(qiáng)對稻菌菌株 Guy11 的抗性。而 DC3000 處理?xiàng)l件下，HvNPR1-Kd 轉(zhuǎn)基因材料相對于野型，可明顯觀察到 AR 反應(yīng)被抑制。上述結(jié)果表明，NPR1 基因在丁香假單胞菌3000 引起的 AR 反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

圖 3 RNA-seq 生物學(xué)重復(fù)間的 Pearson’s 相關(guān)性 （R2> 0.92）CK：清水對照； PST：P. syringae DC3000 處理；OE：小麥 NPR1 過表達(dá)； Kd：大麥 NPR1 沉默F(xiàn)ig.3 Pearson’s correlation of biological replicates in the present RNA-seq assay （R2> 0.92）CK: water infiltration control; PST: P. syringae DC3000 infiltration;OE: wNPR1-OE transgenic line; Kd: HvNPR1-Kd transgenic line PR 基因和 BCI 基因在 NPR1 介導(dǎo)的大麥 AR 中的表達(dá)譜在本課題組前期研究中，利用熒光實(shí)時(shí)定量 qRT-PCR 技術(shù)，多個(gè)病程相關(guān) PR因被證實(shí)為 AR 過程中 NPR1 的下游基因[44]。本研究中，我們整理了所有已知 PR因在 RNA-seq 數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)譜，利用 MeV 軟件對 PR 基因在數(shù)據(jù)庫中的 FPKM做熱圖，其中 HvPR1、HvPR2、HvPR3_Chit2a、HvPR5_TLP6/7/8、HvPR9 和 HvPR13導(dǎo)水平與 NPR1 轉(zhuǎn)基因表達(dá)量顯著（P < 0.05）相關(guān)，表現(xiàn)為在 wNPR1-OE 轉(zhuǎn)基因料中更高或在 HvNPR1-Kd 轉(zhuǎn)基因材料中更低（如圖 4 所示）。而 HvPR5_TLP1、PR15、HvPR16、HvPR17a 和 HvPR17b 表達(dá)水平受丁香假單胞菌 DC3000 顯著誘，但誘導(dǎo)水平與 NPR1 轉(zhuǎn)基因表達(dá)量無關(guān)。我們同樣對另一類大麥中 SA/BTH 敏感 BCI 基因，進(jìn)行了表達(dá)譜分析。結(jié)果表明，HvBCI2 基因和 HvBCI7/HvPR13 基因
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本文編號：2884261