發(fā)布時間：2020-11-15 08:52

　　 藜麥(Chenopodium quinoa Willd)是一種單體植物即可滿足人體基本營養(yǎng)需求的食物,被聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦藜麥為最適宜人類的營養(yǎng)食品。藜麥不僅僅富含多種人類所需的營養(yǎng)素,而且藜麥是少有的擁有著接近人體氨基酸構(gòu)成的植物。目前藜麥的被廣泛應(yīng)用在食品、飼料和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。植源性蛋白酶一般擁有天然無害、催化活力高等特點,在保健食品、化妝品、醫(yī)藥、日常生活用品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。藜麥擁有著動物才具有的完全蛋白,蛋白組成成分在植物中十分罕見,所以它的蛋白酶具有著巨大的開發(fā)潛力和研究價值。本研究以萌發(fā)藜麥為研究對象,對萌發(fā)藜麥中蛋白酶的酸堿性質(zhì)、分離純化方法、酶學(xué)性質(zhì)、提取工藝和培養(yǎng)條件等方面進行了初步研究,論文的主要研究成果如下:(1)為了探討不同種浸提溶劑對酶活力的影響程度。本實驗利用去離子水、Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液提取萌發(fā)藜麥蛋白酶,對于萌發(fā)藜麥蛋白酶來講,磷酸鹽緩沖液對其浸提效果最為突出,而去離子水對其浸提效果最差,說明適宜的無機鹽濃度有利于藜麥蛋白酶的提取。在此基礎(chǔ)上,利用不同酸堿性的底物檢測萌發(fā)藜麥蛋白酶的蛋白酶活力,得出萌發(fā)藜麥蛋白酶在pH值為3的反應(yīng)條件下酶活力最高,是一種酸性蛋白酶。比較了(NH_4)_2SO_4鹽析法和等電點沉淀法對萌發(fā)藜麥中所含的蛋白酶的提純效果,(NH_4)_2SO_4鹽析法和等電點沉淀法提取萌發(fā)藜麥蛋白酶的酶活回收率分別為40.36%和45.30%,比活力分別為4.78 U/mg和5.23 U/mg。所以,優(yōu)選等電點沉淀法從藜麥浸提液種提純萌發(fā)藜麥蛋白酶。(2)在提純出萌發(fā)藜麥蛋白酶粗酶的基礎(chǔ)上,將粗酶液通過HiPrep?Q XL 16/10陰離子交換柱純化,純化效果較理想,使酶的比活力提升到24.74 U/mg,回收率為15.65%,純化倍數(shù)為12.07倍。對純化后的蛋白酶進行電泳分析,結(jié)果表明經(jīng)陰離子純化后的酶液顯示單一條帶,萌發(fā)藜麥蛋白酶的分子量約為55kDa。(3)萌發(fā)藜麥蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的結(jié)果表明,該酶的最適pH為3,最適溫度是60℃,該酶的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性不強。在金屬離子方面,Cu~(2+)和K~+對該蛋白酶有輕微的激活作用,Mn~(2+)激活作用最強,而Zn~(2+)和Fe~(2+)對酶活力有抑制作用。蛋白酶抑制劑方面研究結(jié)果表示,天冬氨酸蛋白酶抑制劑基本抑制了萌發(fā)藜麥酸性蛋白酶的酶活力,因此,萌發(fā)藜麥酸性蛋白酶極有可能是一種天冬氨酸蛋白酶。酶促反應(yīng)動力學(xué)研究表明,在以酪蛋白為底物時,酶對底物的Vmax=0.285 mg/min,Km=3.52 mM。(4)本實驗以萌發(fā)藜麥為原料,乳酸鹽緩沖液為提取溶劑。進一步對提取pH、提取料液比和浸提時間進行單因素實驗。為了使實驗結(jié)果更加科學(xué)準確,進行了3因素3水平的正交實驗。萌發(fā)藜麥蛋白酶活力為指標,優(yōu)化了萌發(fā)藜麥的提取參數(shù),得出提取萌發(fā)藜麥蛋白酶的最佳工藝參數(shù)是萌發(fā)藜麥以料液比為1:6在pH為7.0的緩沖液中充分勻漿,勻漿后4℃浸提30 min。(5)在此基礎(chǔ)上,以萌發(fā)藜麥蛋白酶活力為指標,本實驗還對藜麥的萌發(fā)時間、萌發(fā)溫度、萌發(fā)相對濕度進行了單因素實驗。為了使實驗結(jié)果更加科學(xué)準確,進行了3因素3水平的正交實驗。以萌發(fā)藜麥蛋白酶活力為指標,優(yōu)化了藜麥的萌發(fā)條件,即藜麥種子在環(huán)境溫度為25℃、環(huán)境相對濕度為60%萌發(fā)18 h時所產(chǎn)生的萌發(fā)藜麥酸性蛋白酶活力最高。(6)通過生物信息學(xué)手段,預(yù)測了藜麥天冬氨酸蛋白酶的分子量大小為54.993 kDa,理論等電點為4.56,脂溶性參數(shù)為84.80,總的親水性平均系數(shù)為0.002,糖基化位點分析結(jié)果表明,藜麥天冬氨酸蛋白酶不存在N-糖基化位點。并預(yù)測了該酶在藜麥中的位置(液泡),預(yù)測了藜麥天冬氨酸蛋白酶存在兩個酶活性位點Asp~(94)、Asp~(277),并預(yù)測了它的3D結(jié)構(gòu)。成功將攜帶藜麥天冬氨酸蛋白酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主中,并分析了藜麥蛋白酶未能表達的原因。
【學(xué)位單位】：齊魯工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S519
【部分圖文】：

第二章 萌發(fā)藜麥酸性蛋白酶的分離純化0 1 2 3 標準牛血清蛋白溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0去離子水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0當(dāng)于蛋白質(zhì)含量/ug 0 20 40 60 8論白標準曲線的繪制血清蛋白濃度為橫坐標，595 nm 處 OD 值為縱坐標，繪如圖 2.1 所示。

Proteinase劑 去離子水 Tris-HCl 緩沖液 磷酸 pH 7.0 7.0 U 191.2 257 于萌發(fā)藜麥芽的蛋白酶來講，提取效果為磷酸鹽緩沖液>水，因此實驗選用磷酸鹽緩沖液提取萌發(fā)藜麥蛋白酶的沉淀法純化萌發(fā)藜麥蛋白酶沉淀法可以從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)，由數(shù)小、很難導(dǎo)致溶液中的蛋白質(zhì)變性，被廣泛用于酶的分增加時，蛋白酶在上清液中的溶解度降低，當(dāng)鹽濃度過高因此需要結(jié)合適當(dāng)?shù)柠}濃度來純化蛋白酶。經(jīng)硫酸銨沉淀法處理后收集到的藜麥蛋白酶總活力為指標度，結(jié)果如圖 2.3 所示。

齊魯工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文的(NH4)2SO4沉淀巴西松子蛋白酶結(jié)果相似，而張培[66]等蛋白酶的最佳硫酸銨飽和度為 55 %。這說同種中性鹽對影響程度不同，從而導(dǎo)致了蛋白酶在中性鹽溶液中的溶點沉淀法萌發(fā)藜麥蛋白酶多數(shù)植物蛋白的等電點都處在酸性或弱酸性范圍，通過等去除藜麥粗提液中的雜蛋白，從而達到提純蛋白酶液的目H 在 3-6 范圍內(nèi)的處理情況，以上清液中萌發(fā)藜麥蛋白酶評估萌發(fā)藜麥蛋白酶等電點沉淀法純化結(jié)果。
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張學(xué)峰;劉達玉;夏兵兵;甘廣東;;酒用酸性蛋白酶在甜酒釀生產(chǎn)中的應(yīng)用[J];中國釀造;2009年02期

2 王彥榮,孟祥春,任連彬,許麗霞,姜淑榮;酸性蛋白酶生產(chǎn)與應(yīng)用的研究[J];釀酒;2003年03期

3 唐勝球,董小英,鄒曉庭;飼用酸性蛋白酶研究及其應(yīng)用[J];飼料工業(yè);2002年03期

4 ;飼料用酸性蛋白酶研究[J];糧食與飼料工業(yè);2001年02期

5 唐勝球,董小英,鄒曉庭;飼用酸性蛋白酶研究及其應(yīng)用[J];飼料廣角;2002年09期

6 ;霉菌酸性蛋白酶應(yīng)用于啤酒澄清試驗[J];微生物學(xué)通報;1977年01期

7 何佳 ,趙啟美,李西波;發(fā)酵酸性蛋白酶飼料的研究[J];中國飼料;2002年04期

8 高振華;張寶慶;趙博偉;鄭艷華;趙國先;臧素;趙貴明;;生長獺兔日糧中添加酸性蛋白酶的效果[J];河北畜牧獸醫(yī);1998年01期

9 王亞軍,吳天星,董雪梅,戴賢君;飼用酸性蛋白酶生產(chǎn)研究進展[J];飼料博覽;1999年12期

10 張秀蓮,張寶香;酸性蛋白酶軟化紫貂皮的效果觀察[J];特產(chǎn)研究;1999年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 鄭騰;黑曲霉產(chǎn)酶特性研究及其酶制劑在豬飼料中的應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

2 余翔;紅曲菌肉品發(fā)酵菌株篩選、鑒定及其酸性蛋白酶功能特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 于欣君;扣囊復(fù)膜酵母菌酸性蛋白酶基因在解脂耶羅維亞酵母菌中表達和重組酸性蛋白酶的應(yīng)用[D];中國海洋大學(xué);2011年

4 李靜;海洋酵母菌Metschnikowia reukaufii W6b酸性蛋白酶的生產(chǎn)、基因克隆和表達的研究[D];中國海洋大學(xué);2008年

5 劉忠義;草魚消化系統(tǒng)蛋白酶生化特性的研究[D];江南大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 蔡恒博;萌發(fā)藜麥酸性蛋白酶酶學(xué)分析和生產(chǎn)條件優(yōu)化[D];齊魯工業(yè)大學(xué);2019年

2 劉海燕;假灰綠曲霉酸性蛋白酶Aspergillopepsin Ⅰ的表達及蛋白水解[D];江南大學(xué);2018年

3 董文超;白曲霉酸性蛋白酶在無孢黒曲霉SH-2中的表達研究[D];華南理工大學(xué);2018年

4 戚淑威;產(chǎn)偏酸性蛋白酶菌株的篩選及其酶應(yīng)用特性的研究[D];云南師范大學(xué);2006年

5 吳偉偉;酸性蛋白酶在酒精生產(chǎn)的應(yīng)用[D];北京化工大學(xué);2016年

6 代力強;酸性蛋白酶PEPB基因轉(zhuǎn)化玉米的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 曹治云;黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶催化機制和穩(wěn)定劑研究[D];福建師范大學(xué);2005年

8 吳婷;白曲霉酸性蛋白酶在黑曲霉中的表達研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

9 司曉光;高產(chǎn)酸性蛋白酶的醬油發(fā)酵米曲霉的選育[D];天津科技大學(xué);2014年

10 吳曉艷;產(chǎn)酸性蛋白酶微生物的篩選及其在玉米淀粉生產(chǎn)中的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2011年

本文編號：2884576