發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 08:52

　　 藜麥(Chenopodium quinoa Willd)是一種單體植物即可滿足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的食物,被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦藜麥為最適宜人類的營(yíng)養(yǎng)食品。藜麥不僅僅富含多種人類所需的營(yíng)養(yǎng)素,而且藜麥?zhǔn)巧儆械膿碛兄�接近人體氨基酸構(gòu)成的植物。目前藜麥的被廣泛應(yīng)用在食品、飼料和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。植源性蛋白酶一般擁有天然無害、催化活力高等特點(diǎn),在保健食品、化妝品、醫(yī)藥、日常生活用品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。藜麥擁有著動(dòng)物才具有的完全蛋白,蛋白組成成分在植物中十分罕見,所以它的蛋白酶具有著巨大的開發(fā)潛力和研究?jī)r(jià)值。本研究以萌發(fā)藜麥為研究對(duì)象,對(duì)萌發(fā)藜麥中蛋白酶的酸堿性質(zhì)、分離純化方法、酶學(xué)性質(zhì)、提取工藝和培養(yǎng)條件等方面進(jìn)行了初步研究,論文的主要研究成果如下:(1)為了探討不同種浸提溶劑對(duì)酶活力的影響程度。本實(shí)驗(yàn)利用去離子水、Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液提取萌發(fā)藜麥蛋白酶,對(duì)于萌發(fā)藜麥蛋白酶來講,磷酸鹽緩沖液對(duì)其浸提效果最為突出,而去離子水對(duì)其浸提效果最差,說明適宜的無機(jī)鹽濃度有利于藜麥蛋白酶的提取。在此基礎(chǔ)上,利用不同酸堿性的底物檢測(cè)萌發(fā)藜麥蛋白酶的蛋白酶活力,得出萌發(fā)藜麥蛋白酶在pH值為3的反應(yīng)條件下酶活力最高,是一種酸性蛋白酶。比較了(NH_4)_2SO_4鹽析法和等電點(diǎn)沉淀法對(duì)萌發(fā)藜麥中所含的蛋白酶的提純效果,(NH_4)_2SO_4鹽析法和等電點(diǎn)沉淀法提取萌發(fā)藜麥蛋白酶的酶活回收率分別為40.36%和45.30%,比活力分別為4.78 U/mg和5.23 U/mg。所以,優(yōu)選等電點(diǎn)沉淀法從藜麥浸提液種提純萌發(fā)藜麥蛋白酶。(2)在提純出萌發(fā)藜麥蛋白酶粗酶的基礎(chǔ)上,將粗酶液通過HiPrep?Q XL 16/10陰離子交換柱純化,純化效果較理想,使酶的比活力提升到24.74 U/mg,回收率為15.65%,純化倍數(shù)為12.07倍。對(duì)純化后的蛋白酶進(jìn)行電泳分析,結(jié)果表明經(jīng)陰離子純化后的酶液顯示單一條帶,萌發(fā)藜麥蛋白酶的分子量約為55kDa。(3)萌發(fā)藜麥蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的結(jié)果表明,該酶的最適pH為3,最適溫度是60℃,該酶的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性不強(qiáng)。在金屬離子方面,Cu~(2+)和K~+對(duì)該蛋白酶有輕微的激活作用,Mn~(2+)激活作用最強(qiáng),而Zn~(2+)和Fe~(2+)對(duì)酶活力有抑制作用。蛋白酶抑制劑方面研究結(jié)果表示,天冬氨酸蛋白酶抑制劑基本抑制了萌發(fā)藜麥酸性蛋白酶的酶活力,因此,萌發(fā)藜麥酸性蛋白酶極有可能是一種天冬氨酸蛋白酶。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究表明,在以酪蛋白為底物時(shí),酶對(duì)底物的Vmax=0.285 mg/min,Km=3.52 mM。(4)本實(shí)驗(yàn)以萌發(fā)藜麥為原料,乳酸鹽緩沖液為提取溶劑。進(jìn)一步對(duì)提取pH、提取料液比和浸提時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加科學(xué)準(zhǔn)確,進(jìn)行了3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)。萌發(fā)藜麥蛋白酶活力為指標(biāo),優(yōu)化了萌發(fā)藜麥的提取參數(shù),得出提取萌發(fā)藜麥蛋白酶的最佳工藝參數(shù)是萌發(fā)藜麥以料液比為1:6在pH為7.0的緩沖液中充分勻漿,勻漿后4℃浸提30 min。(5)在此基礎(chǔ)上,以萌發(fā)藜麥蛋白酶活力為指標(biāo),本實(shí)驗(yàn)還對(duì)藜麥的萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)溫度、萌發(fā)相對(duì)濕度進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)。為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加科學(xué)準(zhǔn)確,進(jìn)行了3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)。以萌發(fā)藜麥蛋白酶活力為指標(biāo),優(yōu)化了藜麥的萌發(fā)條件,即藜麥種子在環(huán)境溫度為25℃、環(huán)境相對(duì)濕度為60%萌發(fā)18 h時(shí)所產(chǎn)生的萌發(fā)藜麥酸性蛋白酶活力最高。(6)通過生物信息學(xué)手段,預(yù)測(cè)了藜麥天冬氨酸蛋白酶的分子量大小為54.993 kDa,理論等電點(diǎn)為4.56,脂溶性參數(shù)為84.80,總的親水性平均系數(shù)為0.002,糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果表明,藜麥天冬氨酸蛋白酶不存在N-糖基化位點(diǎn)。并預(yù)測(cè)了該酶在藜麥中的位置(液泡),預(yù)測(cè)了藜麥天冬氨酸蛋白酶存在兩個(gè)酶活性位點(diǎn)Asp~(94)、Asp~(277),并預(yù)測(cè)了它的3D結(jié)構(gòu)。成功將攜帶藜麥天冬氨酸蛋白酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主中,并分析了藜麥蛋白酶未能表達(dá)的原因。
【學(xué)位單位】：齊魯工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S519
【部分圖文】：

第二章 萌發(fā)藜麥酸性蛋白酶的分離純化0 1 2 3 標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0去離子水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0當(dāng)于蛋白質(zhì)含量/ug 0 20 40 60 8論白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，595 nm 處 OD 值為縱坐標(biāo)，繪如圖 2.1 所示。

Proteinase劑 去離子水 Tris-HCl 緩沖液 磷酸 pH 7.0 7.0 U 191.2 257 于萌發(fā)藜麥芽的蛋白酶來講，提取效果為磷酸鹽緩沖液>水，因此實(shí)驗(yàn)選用磷酸鹽緩沖液提取萌發(fā)藜麥蛋白酶的沉淀法純化萌發(fā)藜麥蛋白酶沉淀法可以從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)，由數(shù)小、很難導(dǎo)致溶液中的蛋白質(zhì)變性，被廣泛用于酶的分增加時(shí)，蛋白酶在上清液中的溶解度降低，當(dāng)鹽濃度過高因此需要結(jié)合適當(dāng)?shù)柠}濃度來純化蛋白酶。經(jīng)硫酸銨沉淀法處理后收集到的藜麥蛋白酶總活力為指標(biāo)度，結(jié)果如圖 2.3 所示。

齊魯工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文的(NH4)2SO4沉淀巴西松子蛋白酶結(jié)果相似，而張培[66]等蛋白酶的最佳硫酸銨飽和度為 55 %。這說同種中性鹽對(duì)影響程度不同，從而導(dǎo)致了蛋白酶在中性鹽溶液中的溶點(diǎn)沉淀法萌發(fā)藜麥蛋白酶多數(shù)植物蛋白的等電點(diǎn)都處在酸性或弱酸性范圍，通過等去除藜麥粗提液中的雜蛋白，從而達(dá)到提純蛋白酶液的目H 在 3-6 范圍內(nèi)的處理情況，以上清液中萌發(fā)藜麥蛋白酶評(píng)估萌發(fā)藜麥蛋白酶等電點(diǎn)沉淀法純化結(jié)果。
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本文編號(hào)：2884576