發(fā)布時間：2020-11-15 04:44

　　 過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)輔助激活因子1α(PPARγcoactivator-1α,PGC-1α)是一個重要的能量調(diào)節(jié)因子,不僅能調(diào)控生命活動基本的代謝活動如脂質(zhì)和糖類的代謝,同時也能調(diào)節(jié)線粒體的生物合成并行使正常的功能。PGC-1α的分布范圍十分廣泛,在(brown adipose tissue,BAT)褐色脂肪組織、心臟、大腦、肝臟、肌肉等多個組織中均能檢測到其表達,且在不同類型組織中具有不同的表達量。PGC-1α基因的結(jié)構(gòu)包含C端的轉(zhuǎn)錄激活域、中間的轉(zhuǎn)錄抑制域、一個富含絲氨酸及精氨酸殘基的模體結(jié)構(gòu)以及N端的RNA結(jié)合域。作為一個參與各個生理生化過程的關(guān)鍵調(diào)控分子,PGC-1α被認(rèn)為是機體或細胞外部信號的主要感受器。它能被諸多因素激活:1.活性氧類和活性氮類物質(zhì)(ROS)和(RNS)。這兩者均為細胞內(nèi)源性的代謝副產(chǎn)物,當(dāng)細胞受到應(yīng)激時,上述兩種活性物質(zhì)的含量均上升;2.低溫誘導(dǎo)。當(dāng)機體暴露在冷環(huán)境中,PGC-1α的表達量顯著性上升,通過促進機體的適應(yīng)性產(chǎn)熱以適應(yīng)低溫環(huán)境造成的影響;3.鍛煉、長時間的耐力型訓(xùn)練均能引起PGC-1α的表達量升高。此外還有多種重要的信號通路參與調(diào)控PGC-1α的轉(zhuǎn)錄和表達。PGC-1α最初被發(fā)現(xiàn)是由于其在寒冷暴露下,在棕色脂肪中作為一個冷誘導(dǎo)調(diào)控因子能增加適應(yīng)性產(chǎn)熱。哺乳動物暴露在寒冷環(huán)境中,其作為恒溫動物主要通過骨骼肌顫栗、增加有氧呼吸產(chǎn)生ATP和熱量以維持低溫下正常的生理活動;當(dāng)植物暴露于寒冷環(huán)境中,蛋白質(zhì)和核酸構(gòu)象發(fā)生改變、細胞膜的流動性降低,主要通過增加冷誘導(dǎo)蛋白的表達量從而引起下游信號通路以適應(yīng)低溫。關(guān)于PGC-1α在機體受到低溫刺激過程中所起作用的相關(guān)的研究主要集中于哺乳動物模型,而其功能在魚類中鮮有報道。因此本研究以斑馬魚胚胎成纖維細胞ZF4細胞為實驗?zāi)Ｐ?通過構(gòu)建慢病毒載體并轉(zhuǎn)染ZF4細胞,以干擾細胞內(nèi)源性的PGC-1α的表達量;并利用嘌呤霉素篩選獲得PGC-1α敲降的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,并給與其18°C、10°C不同程度和不同時間的低溫刺激,以探究PGC-1α在ZF4冷應(yīng)激過程中所起的功能。野生型的斑馬魚ZF4細胞18°C 1~7 d的低溫處理后,PGC-1α的mRNA表達量較28°C正常溫度下生長的細胞顯著性上升。以上證實低溫刺激誘導(dǎo)ZF4細胞內(nèi)PGC-1α的表達量升高。為探究低溫刺激下PGC-1α對ZF4細胞所起的功能,本研究根據(jù)NCBI網(wǎng)站上斑馬魚PGC-1α基因的編碼區(qū)序列設(shè)計了PGC-1α的4個shRNA:分別對應(yīng)其CDS區(qū)第165、457、1486、2487位堿基起始長度為21 bp的片段。轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒后,ZF4細胞中PGC-1α的表達量進行檢測發(fā)現(xiàn),4個敲降位點對應(yīng)的敲降比例分別為43%、38%、25%和50%,故選擇轉(zhuǎn)染PGC-1α-shRNA4的細胞作為后續(xù)的實驗組。本研究分為三組:空白對照組(pLKO.DEST.EGFP)、陰性對照組(pLKO.1-shNC)和實驗組(pLKO.1-shRNA)。將以上三組細胞分別在18°C和10°C處理1d、4d、7d后用,通過CM-H2DCFDA探針染色后流式細胞儀檢測對照組、PGC-1α-shNC和PGC-1α-sh4三組細胞內(nèi)的ROS水平發(fā)現(xiàn),在28°C時,PGC-1α敲降不影響細胞內(nèi)ROS的含量;而給予ZF4細胞18°C不同時間的低溫刺激后,PGC-1α敲降組(PGC-1α-sh4)細胞內(nèi)的ROS含量高于空白對照組和陰性對照組:18°C 1 d(0.93±0.03 vs 0.79±0.03,p0.001)、18°C4 d(2.10±0.15 vs 1.24±0.06,p0.01)和18°C 7 d(4.00±0.16 vs 2.87±0.15,p0.01)。ZF4細胞10°C處理1 d、4 d、7 d后,ROS的表達量增加并且隨著冷處理時間的延長,ROS在細胞內(nèi)有累積的趨勢。這也從側(cè)面反應(yīng)在低溫刺激下,PGC-1α能使體內(nèi)ROS含量維持在相對穩(wěn)定的水平范圍內(nèi),從而減緩低溫下產(chǎn)生的ROS對細胞造成的損傷。線粒體有氧呼吸伴隨著ROS的產(chǎn)生,如果ROS在細胞內(nèi)大量的積累,那么首先會危害到產(chǎn)生ROS的場所——線粒體。因此,我們又采用JC-1染色,通過BD C6流式細胞儀檢測到PGC-1α敲降后的ZF4細胞經(jīng)冷處理后其線粒體膜電位(MMP)發(fā)生顯著性降低。正常情況下,膜電位正常的細胞占所有細胞的99%以上,而低溫處理后,細胞的膜電位會發(fā)生一定程度的下降,PGC-1α敲除后細胞的膜電位下降加劇。同時,PGC-1α敲降的細胞在MMP下降后繼而導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡的現(xiàn)象,其中早期凋亡的細胞所占的比例較PGC-1α未敲除的細胞顯著性上升。另一方面,bax(促進細胞發(fā)生凋亡的蛋白)和bcl-2(抵抗細胞凋亡發(fā)生的蛋白)兩者的比率在PGC-1α敲降的細胞中顯著性減小,bax的蛋白水平顯著性升高,與之相反bcl-2的蛋白水平顯著性降低,說明PGC-1α敲降后給予ZF4細胞低溫刺激繼而引發(fā)細胞凋亡。綜上所述,冷應(yīng)激過程中PGC-1α的敲降會引起細胞內(nèi)ROS水平升高,線粒體中MMP下降,bax蛋白的表達升高而bcl-2的表達降低,引發(fā)內(nèi)源性的由線粒體為中心而引發(fā)的細胞凋亡通路。這也從另一個角度證明了PGC-1α在ZF4細胞受到冷刺激后能保護其免受低溫的危害,能通過維持ZF4細胞內(nèi)的ROS水平和MMP以適應(yīng)冷應(yīng)激產(chǎn)生的一系列應(yīng)答反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

圖 1-1 PGC-1 家族中共激活因子的結(jié)構(gòu)和功能[18]家族中 PGC-1α、PGC-1β 和 PRC 的序列相似性比較。三種 PGC-1 家結(jié)構(gòu)域：標(biāo)注紅色的為激活區(qū)域，標(biāo)注黃色的為富含 Arg / Ser 結(jié)bingding domin。 PGC-1α 和 PGC-1β 具有相似的結(jié)構(gòu)域，這些區(qū)域活區(qū)域(40%)、中間的轉(zhuǎn)錄區(qū)域(35%)和 C 端的 RNA 結(jié)合區(qū)域(48C-1α 結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物。 PGC-1α 分別在氨基和羧基末端與 HA復(fù)合物結(jié)合。 SirT1 和 p160 與阻遏結(jié)構(gòu)域結(jié)合，其還包含三個 p磷酸化位點。Figure 1-1 Structure and function of coactivators in the PGC-1 family.son of sequence similarities of PGC-1α, PGC-1β, and PRC in the PGC-1 PGC-1 family members have the following three domains: the red-labelellow-enriched Arg/Ser domain, and the purple-labeled RNA-binding doβ have similar domains, and these regions are mainly the N-terminal actintermediate transcription region (35%) and the C-terminal RNAbindingB) Protein complexes that bind to PGC-1α. PGC-1α binds to the HAT an/intermediator complexes at the amino and carboxyl ends, respectively. Sression domain that also contains three p38 MAP kinase phosphorylation

圖 1-2 PGC-1 家族在幾種重要的脊椎動物中的保守性[18]（Clustal）對 GenBank 中目前 PGC-1 家族中存在的已知的氨在某些物種中缺少某些成員可能是由于可用數(shù)據(jù)庫中缺乏全長 ure 1-2 Conservation of PGC-1 Family in Several Important Verteblustal software to compare the sequence of known amino acids pres in GenBank. The lack of certain members in some species may be dfull-length cDNAsequences in available databases. 的功能α 與線粒體生物合成 DNA 復(fù)制和增殖受到 PGC-1α 的直接調(diào)控。有研究發(fā)位表達 PGC-1α，能直接促進線粒體生物合成的增加。另吸轉(zhuǎn)錄激活因子 1 和 2(Nuclear respiratoryfactor1 and

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 PGC-1α 的小鼠中，心肌細胞中的線粒體數(shù)目明顯增多。此外，PG活并提高 NRF-1 的表達量，通過介導(dǎo) UCP-2 的合成促進心肌細胞中成。雖然在 PGC-1α 過表達的組織中存在著線粒體數(shù)量顯著上升的現(xiàn)因子與這些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之間發(fā)生互作，PGC-1α 的敲除小鼠仍然存常的線粒體豐度[26]。因此，PGC-1α 對于小鼠線粒體的正常發(fā)育不是當(dāng)置于生理壓力下時，與具有正常水平的 PGC-1α 的小鼠相比，這些受性降低[27]。類似地，在 PGC-1β 破壞的基因敲除小鼠中，小鼠顯體功能正常水平，并且適應(yīng)生理應(yīng)激的能力降低。然而，PGC-1α/β 產(chǎn)生了大多數(shù)在 24 小時內(nèi)因心臟組織線粒體缺陷而導(dǎo)致死亡的小鼠結(jié)果說明 PGC-1α 和 PGC-1β 兩者單獨敲除后不影響細胞執(zhí)行線粒體力，但它們能夠在生理應(yīng)激期間相互補償以獲得最佳的線粒體數(shù)量
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本文編號：2884358