殺香魚假單胞菌魚體內(nèi)分布及其溶血素相關(guān)蛋白Hcp的克
發(fā)布時間：2020-12-10 11:22
大黃魚（Larimichthys crocea）是我國海水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類之一,因其營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美一直受到消費者的青睞。但是近年來,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,大黃魚產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的升級與發(fā)展,大黃魚的病害已成為制約大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要屏障。大黃魚“內(nèi)臟白點病”是近年影響大黃魚養(yǎng)殖的重要細菌性疾病。本研究通過人工回感實驗,運用組織病理切片與免疫組化技術(shù)觀察了大黃魚“內(nèi)臟白點病”病原——殺香魚假單胞菌在大黃魚體內(nèi)的分布情況;對殺香魚假單胞菌的溶血素共調(diào)節(jié)蛋白基因Hcp進行克隆、表達,并獲得了以包涵體形式的重組蛋白Hcp,通過蛋白復性后成功獲得可溶性蛋白,可運用于殺香魚假單胞菌T6SS分泌系統(tǒng)中溶血素共調(diào)節(jié)蛋白Hcp深層研究。對健康大黃魚進行殺香魚假單胞菌人工感染試驗,結(jié)果大黃魚表現(xiàn)出了典型的“內(nèi)臟白點病”的癥狀:病魚無活力,反應遲鈍。解剖發(fā)現(xiàn)脾、腎臟、肝臟等內(nèi)部器官上長滿白點,并伴隨腹水癥狀。對發(fā)病魚進行組織病理觀察,發(fā)病魚肝、脾、腎等內(nèi)臟組織都出現(xiàn)明顯損傷,表現(xiàn)出不同程度的充血、出血、壞死等,隨著菌體在大黃魚體內(nèi)大量增殖,大黃魚全身多器官組織的細胞出現(xiàn)壞死溶解,最終導致感染魚因多組織器...
【文章來源】：浙江海洋大學浙江省
【文章頁數(shù)】：66 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
T6SS分泌系統(tǒng)模型
孵育盒后 4℃冰箱過夜。切片放入 PBS 緩沖液中清洗 3min 后晾干液體后滴加 70μL 羊抗兔 IgG 聚合物，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育液洗滌 3min 后換液，重復 3 次。染色：滴加適量 DAB 顯色劑，室溫顯色 5-20min，蒸餾水終止染液中染色 40s，水洗 1min。1%鹽酸酒精溶液分化 3s，流水漂洗。封片：切片依次放入 85%乙醇，95%乙醇各 1min，無水乙置于二甲苯 I、II 各 2min。使用中性樹膠封片，利用顯微鏡拍感試驗結(jié)果魚注射 24 h 后出現(xiàn)游動緩慢，應激反應遲鈍等臨床癥狀；注射現(xiàn)死亡，試驗進行至 10d 時試驗組所有大黃魚均死亡。對照組表無潰瘍等癥狀，主要是鰓充血，部分魚吻部充血。剖解病死充血嚴重，脾臟布滿白色小結(jié)節(jié)，其中腎臟白色結(jié)節(jié)較脾臟大
圖 2-2 病魚脾臟中病原菌分離培養(yǎng)(左：TCBS 培養(yǎng)基；右：TSA 培養(yǎng)基)Fig.2-2 Isolation and culture of pathogenic bacteria from the spleen of Pseudosciaena crocea (left:TCBS medium; right: TSA medium)3.2 組織病理學變化及特征觀察臨床解剖觀察顯示試驗組感染魚的肝、脾、腎等內(nèi)臟組織與器官都表現(xiàn)出不同程度的充血、出血、壞死等。肝細胞發(fā)生廣泛性變性，壞死、溶解，有大量的炎性細胞浸潤；腎小管上皮細胞腫脹變性，腎間質(zhì)巨唾細胞和中性粒細胞浸潤、嚴重空泡變性、壞死崩解；脾臟少量含鐵血黃素的沉積，淋巴細胞壞死，中性粒細胞和大量巨噬細胞浸潤。感染魚肝臟充血，肝血竇與中央靜脈瘀血更清晰，肝血竇、中央靜脈以及一些肝細胞內(nèi)可發(fā)現(xiàn)病原菌；肝細胞腫脹明顯，肝板排列不齊，其中病變嚴重的區(qū)域失去原有網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)，形成壞死灶。細胞核固縮，細胞質(zhì)染色變深呈嗜堿性，細胞結(jié)構(gòu)被破壞，空泡化嚴重。其中壞死灶中心區(qū)內(nèi)充滿解體后的細胞碎片，部分肝細胞肝細胞其器官功能受到嚴重破壞。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]大黃魚主要致病菌拮抗菌株的分離鑒定、抑菌譜及安全性分析[J]. 傅超英,王建平,孫琛,陳琳,錢冬. 生物技術(shù)通報. 2019(01)
[2]大黃魚(Pseudosciaena crocea)內(nèi)臟白點病的組織病理和超微病理分析[J]. 張丹楓,安樹偉,周素明,王國良. 漁業(yè)科學進展. 2017(04)
[3]2014—2016年浙江省大黃魚養(yǎng)殖病害測報及防治建議[J]. 曹飛飛,朱凝瑜,鄭曉葉. 浙江農(nóng)業(yè)科學. 2017(06)
[4]水貂出血性肺炎的診斷與防治[J]. 姜旭東. 中國畜牧獸醫(yī)文摘. 2017(04)
[5]大黃魚致病香魚假單胞菌對環(huán)境因子的響應及其感染檢測的分析[J]. 袁雪梅,葛明峰,安樹偉,張繼挺,陶震,王國良. 應用海洋學學報. 2015(04)
[6]大黃魚內(nèi)臟白點病病原殺香魚假單胞菌及其毒力因子研究進展[J]. 張杰,毛芝娟. 浙江萬里學院學報. 2015(06)
[7]大黃魚(Pseudosciaena crocea)內(nèi)臟白點病病原分離鑒定及致病性研究[J]. 胡嬌,張飛,徐曉津,蘇永全,覃映雪,馬英,張藝,韓坤煌,鄢慶枇. 海洋與湖沼. 2014(02)
[8]豬溶血性鏈球菌的分離鑒定及溶血素基因的PCR檢測[J]. 徐珊珊,黃仆,劉濤,代洪波,吳云飛,劉孟良,朱玲. 黑龍江畜牧獸醫(yī). 2012(07)
[9]我國大黃魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀與對策[J]. 劉家富,韓坤煌. 福建水產(chǎn). 2011(05)
[10]細菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)的研究進展[J]. 李俊,俞盈,王豪舉. 微生物學報. 2011(03)
博士論文
[1]銅綠假單胞菌T6SS效應蛋白Tse1、Tse3及其免疫蛋白Tsi1、Tsi3結(jié)構(gòu)與功能的研究[D]. 盧德芬.山東大學 2013
[2]鰻弧菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS）的功能及調(diào)控研究[D]. 郝彬.中國科學院研究生院（海洋研究所） 2012
[3]遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）輸送器蛋白及分子伴侶的研究[D]. 王波.中國科學院研究生院（海洋研究所） 2009
碩士論文
[1]六型分泌系統(tǒng)在豬源腸外致病性大腸桿菌引起宿主天然免疫過程中的作用研究[D]. 于菲菲.華中農(nóng)業(yè)大學 2018
[2]惡臭假單胞菌KT2442鞭毛關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)晟飳W特性的影響[D]. 王雨舟.江南大學 2018
[3]病原菌中六型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白Hcp的結(jié)構(gòu)與功能研究[D]. 林清鵬.中國科學技術(shù)大學 2017
[4]單環(huán)刺螠纖溶酶的重組表達及活性研究[D]. 孫雪燕.中國海洋大學 2015
[5]腸外致病性大腸桿菌VI型分泌系統(tǒng)的功能研究[D]. 壽琎.華中農(nóng)業(yè)大學 2013
[6]大黃魚內(nèi)臟白點病的病原及組織病理研究[D]. 安樹偉.寧波大學 2013
[7]禾谷鐮孢菌β-微管蛋白的原核表達、復性純化和單克隆抗體的制備[D]. 張聰.南京農(nóng)業(yè)大學 2009
[8]對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP33的功能研究和非結(jié)構(gòu)蛋白wsv406的初步鑒定[D]. 林易.廈門大學 2008
本文編號：2908609
【文章來源】：浙江海洋大學浙江省
【文章頁數(shù)】：66 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
T6SS分泌系統(tǒng)模型
孵育盒后 4℃冰箱過夜。切片放入 PBS 緩沖液中清洗 3min 后晾干液體后滴加 70μL 羊抗兔 IgG 聚合物，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育液洗滌 3min 后換液，重復 3 次。染色：滴加適量 DAB 顯色劑，室溫顯色 5-20min，蒸餾水終止染液中染色 40s，水洗 1min。1%鹽酸酒精溶液分化 3s，流水漂洗。封片：切片依次放入 85%乙醇，95%乙醇各 1min，無水乙置于二甲苯 I、II 各 2min。使用中性樹膠封片，利用顯微鏡拍感試驗結(jié)果魚注射 24 h 后出現(xiàn)游動緩慢，應激反應遲鈍等臨床癥狀；注射現(xiàn)死亡，試驗進行至 10d 時試驗組所有大黃魚均死亡。對照組表無潰瘍等癥狀，主要是鰓充血，部分魚吻部充血。剖解病死充血嚴重，脾臟布滿白色小結(jié)節(jié)，其中腎臟白色結(jié)節(jié)較脾臟大
圖 2-2 病魚脾臟中病原菌分離培養(yǎng)(左：TCBS 培養(yǎng)基；右：TSA 培養(yǎng)基)Fig.2-2 Isolation and culture of pathogenic bacteria from the spleen of Pseudosciaena crocea (left:TCBS medium; right: TSA medium)3.2 組織病理學變化及特征觀察臨床解剖觀察顯示試驗組感染魚的肝、脾、腎等內(nèi)臟組織與器官都表現(xiàn)出不同程度的充血、出血、壞死等。肝細胞發(fā)生廣泛性變性，壞死、溶解，有大量的炎性細胞浸潤；腎小管上皮細胞腫脹變性，腎間質(zhì)巨唾細胞和中性粒細胞浸潤、嚴重空泡變性、壞死崩解；脾臟少量含鐵血黃素的沉積，淋巴細胞壞死，中性粒細胞和大量巨噬細胞浸潤。感染魚肝臟充血，肝血竇與中央靜脈瘀血更清晰，肝血竇、中央靜脈以及一些肝細胞內(nèi)可發(fā)現(xiàn)病原菌；肝細胞腫脹明顯，肝板排列不齊，其中病變嚴重的區(qū)域失去原有網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)，形成壞死灶。細胞核固縮，細胞質(zhì)染色變深呈嗜堿性，細胞結(jié)構(gòu)被破壞，空泡化嚴重。其中壞死灶中心區(qū)內(nèi)充滿解體后的細胞碎片，部分肝細胞肝細胞其器官功能受到嚴重破壞。
【參考文獻】：
期刊論文
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[3]2014—2016年浙江省大黃魚養(yǎng)殖病害測報及防治建議[J]. 曹飛飛,朱凝瑜,鄭曉葉. 浙江農(nóng)業(yè)科學. 2017(06)
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[5]大黃魚致病香魚假單胞菌對環(huán)境因子的響應及其感染檢測的分析[J]. 袁雪梅,葛明峰,安樹偉,張繼挺,陶震,王國良. 應用海洋學學報. 2015(04)
[6]大黃魚內(nèi)臟白點病病原殺香魚假單胞菌及其毒力因子研究進展[J]. 張杰,毛芝娟. 浙江萬里學院學報. 2015(06)
[7]大黃魚(Pseudosciaena crocea)內(nèi)臟白點病病原分離鑒定及致病性研究[J]. 胡嬌,張飛,徐曉津,蘇永全,覃映雪,馬英,張藝,韓坤煌,鄢慶枇. 海洋與湖沼. 2014(02)
[8]豬溶血性鏈球菌的分離鑒定及溶血素基因的PCR檢測[J]. 徐珊珊,黃仆,劉濤,代洪波,吳云飛,劉孟良,朱玲. 黑龍江畜牧獸醫(yī). 2012(07)
[9]我國大黃魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀與對策[J]. 劉家富,韓坤煌. 福建水產(chǎn). 2011(05)
[10]細菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)的研究進展[J]. 李俊,俞盈,王豪舉. 微生物學報. 2011(03)
博士論文
[1]銅綠假單胞菌T6SS效應蛋白Tse1、Tse3及其免疫蛋白Tsi1、Tsi3結(jié)構(gòu)與功能的研究[D]. 盧德芬.山東大學 2013
[2]鰻弧菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS）的功能及調(diào)控研究[D]. 郝彬.中國科學院研究生院（海洋研究所） 2012
[3]遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）輸送器蛋白及分子伴侶的研究[D]. 王波.中國科學院研究生院（海洋研究所） 2009
碩士論文
[1]六型分泌系統(tǒng)在豬源腸外致病性大腸桿菌引起宿主天然免疫過程中的作用研究[D]. 于菲菲.華中農(nóng)業(yè)大學 2018
[2]惡臭假單胞菌KT2442鞭毛關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)晟飳W特性的影響[D]. 王雨舟.江南大學 2018
[3]病原菌中六型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白Hcp的結(jié)構(gòu)與功能研究[D]. 林清鵬.中國科學技術(shù)大學 2017
[4]單環(huán)刺螠纖溶酶的重組表達及活性研究[D]. 孫雪燕.中國海洋大學 2015
[5]腸外致病性大腸桿菌VI型分泌系統(tǒng)的功能研究[D]. 壽琎.華中農(nóng)業(yè)大學 2013
[6]大黃魚內(nèi)臟白點病的病原及組織病理研究[D]. 安樹偉.寧波大學 2013
[7]禾谷鐮孢菌β-微管蛋白的原核表達、復性純化和單克隆抗體的制備[D]. 張聰.南京農(nóng)業(yè)大學 2009
[8]對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP33的功能研究和非結(jié)構(gòu)蛋白wsv406的初步鑒定[D]. 林易.廈門大學 2008
本文編號：2908609
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