發(fā)布時間：2020-10-17 04:57

　　 絲狀真菌米曲霉是發(fā)酵工業(yè)的重要菌種,具有良好的蛋白分泌能力和較高的食品安全性。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),重組構(gòu)建了5株新型米曲霉工程菌,將其應(yīng)用于豆粕原料的發(fā)酵,比較和研究了外源蛋白酶基因的導(dǎo)入對米曲霉發(fā)酵作用的影響,并對菌株所表達的外源蛋白酶進行了分離純化及酶學(xué)特性的研究。研究結(jié)果對于以米曲霉為宿主的外源基因的轉(zhuǎn)化和調(diào)控,以及米曲霉優(yōu)良菌株的選育具有重要的意義。本研究首先應(yīng)用PCR擴增的方法從地衣芽胞桿菌、短小芽孢桿菌和黑曲霉中擴增到了3個堿性蛋白酶基因和3個酸性蛋白酶基因。運用生物信息學(xué)的方法對蛋白酶基因進行序列分析和氨基酸序列預(yù)測。以雙元表達載體pCAMBIA1304為載體骨架,通過連入米曲霉高效表達元件淀粉酶啟動子和糖苷酶終止子構(gòu)建米曲霉表達閱讀框。在表達閱讀框中分別連入單個外源蛋白酶基因,構(gòu)建了4個表達載體paa-subC、paa-asp、paa-Ap、paa-pep。采用以自剪切肽(T2A肽)作為連接的策略,將兩個堿性蛋白酶基因subC和asp連入表達載體中,構(gòu)建了堿性蛋白酶串聯(lián)表達載體paa-sTa,以研究多順反子載體在米曲霉中的表達情況。絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)較為復(fù)雜,相同的轉(zhuǎn)化方法在不同種屬間的轉(zhuǎn)化效率差別較大,甚至在不同亞種之間也會有很大差異。本研究對米曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化體系進行了研究,應(yīng)用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染米曲霉,以潮霉素作為篩選標記,并對影響轉(zhuǎn)化效率的米曲霉孢子濃度、農(nóng)桿菌菌液濃度、共培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)溫度等條件進行優(yōu)化,建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的米曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果顯示在預(yù)培養(yǎng)時加入誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮可顯著提高轉(zhuǎn)化效率,當根瘤農(nóng)桿菌的OD_(600)為0.6,米曲霉孢子濃度為10~7/m L個孢子,28℃時共培養(yǎng)3d,轉(zhuǎn)化效率最高。驗證結(jié)果顯示外源目的基因已成功導(dǎo)入米曲霉基因組中,說明根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法可以應(yīng)用于米曲霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng),研究結(jié)果為米曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化提供了新的途徑,對曲霉類絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化具有一定的借鑒作用。利用構(gòu)建的米曲霉重組工程菌發(fā)酵底物豆粕,考察不同菌株發(fā)酵的蛋白酶活力、多肽轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵產(chǎn)物分子量組成及抗氧化活性。研究結(jié)果顯示外源蛋白酶基因的導(dǎo)入可顯著提高米曲霉工程菌的蛋白酶活力,其中米曲霉asp堿性蛋白酶活力為165U/mL,與野生型米曲霉相比提高了140%;米曲霉pep的酸性蛋白酶活力為143U/mL,比野生型提高了242%。改造后的工程菌對原料的水解效率和多肽產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率也有所提高,米曲霉pep的多肽轉(zhuǎn)化率達到35.89%,為野生型的2倍。發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸含量分析結(jié)果顯示不同菌株發(fā)酵產(chǎn)品中游離氨基酸總量、必需氨基酸總量均存在差異。發(fā)酵豆粕SDS-PAGE電泳分析及掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,基因工程改造可加強菌株對底物的水解作用。應(yīng)用超濾及凝膠過濾的方法,對不同工程菌發(fā)酵豆粕后的產(chǎn)物進行分離,并對分離后的各組分的抗氧化活性進行比較。結(jié)果顯示米曲霉pep發(fā)酵獲得的小分子肽比例較大;與野生型米曲霉發(fā)酵產(chǎn)物相比,各工程菌發(fā)酵產(chǎn)物不同組分的抗氧化活性均有不同程度提高,其中米曲霉pep發(fā)酵產(chǎn)物組分Ⅰ抗氧化活性較好。為進一步提高菌株發(fā)酵性能,應(yīng)用響應(yīng)面法對米曲霉pep發(fā)酵豆粕產(chǎn)多肽的條件進行優(yōu)化,結(jié)果顯示當發(fā)酵時間為108h,發(fā)酵溫度31℃,接菌量為8%時,多肽轉(zhuǎn)化率達40.4%。選取蛋白酶活力相對較高的米曲霉工程菌asp和米曲霉pep,應(yīng)用硫酸銨鹽析、DEAE陰離子交換層析和葡聚糖凝膠層析對所表達的堿性蛋白酶ASP和酸性蛋白酶PEP進行了分離純化,并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了初步研究。電泳結(jié)果顯示重組堿性蛋白酶分子量約為31 kD,重組酸性蛋白酶分子量約為40 kD;兩種酶的純化倍數(shù)分別為5.64倍和3.85倍,分別對純化的兩種蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。所獲得結(jié)果對于利用米曲霉作為外源基因表達的細胞工廠,探索外源基因在米曲霉中的轉(zhuǎn)化、表達和調(diào)控具有一定的參考價值。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ925
【部分圖文】：

圖 1-2 2A 肽在多順反子載體構(gòu)建中的裂解機制Fig.1-2 Mechanism of self-processing of 2Apeptide in construction of polycistron expression vect

微生物蛋白酶.1 微生物蛋白酶的分類蛋白酶的主要作用是催化蛋白質(zhì)水解，在水解底物大分子時獲得小分子的微生物蛋白酶作為蛋白酶的主要來源被廣泛研究。按照酶切位點的不同，蛋白酶分為內(nèi)肽酶和外肽酶；根據(jù)催化機制的不同又可將微生物蛋白酶分酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶。目前較廣泛的是按同將其分為堿性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶(Sabotic，2012)。.2 堿性蛋白酶圖 1-3 不同 2A 肽的 DNA 序列及其相應(yīng)氨基酸組成Fig.1-3 DNAand corresponding amino acid sequences of various 2Apeptides

2.2.1 堿性蛋白酶基因擴增的結(jié)果2.2.1.1 地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶基因 subC、aprB 擴增的結(jié)果從地衣芽孢桿菌細胞中提取基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2-1所示，所提取DNA質(zhì)量較好，可以作為PCR擴增的模板使用。以地衣芽孢桿菌細胞基因組DNA為模板，PCR擴增subC基因，結(jié)果如圖2-2所示，通過擴增在1000-2000bp之間獲得一DNA條帶，大小如文獻相符，將其回收后與測序載體連接進行測序。同樣方法獲得的aprB基因片段如圖2-3所示，其大小與預(yù)期基因大小一致，回收后測序。1500025001000250M 1 2圖 2-1 地衣芽孢桿菌基因組 DNA 檢測結(jié)果Fig.2-1 Result of Bacillus lich
【參考文獻】

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本文編號：2844307