發(fā)布時(shí)間：2020-10-17 18:20

　　 二十二碳六烯酸(DHA)屬于ω-3不飽和脂肪酸,對(duì)嬰幼兒的腦部和視網(wǎng)膜發(fā)育極為重要。木質(zhì)纖維素來(lái)源豐富且環(huán)保,分布廣泛,價(jià)格低廉,木質(zhì)纖維素作為可再生及環(huán)保的新能源是未來(lái)能源利用和開發(fā)的一個(gè)趨勢(shì)。本文以裂殖壺菌Aurantiochytrium sp.FJU-512為出發(fā)菌株,建立了裂殖壺菌常溫常壓等離子體(ARTP)誘變及自然馴化的方法,獲得了對(duì)木質(zhì)纖維素水解液抑制物高耐受性和高產(chǎn)DHA的菌株。在此基礎(chǔ)上,對(duì)裂殖壺菌突變株在甘蔗渣水解液培養(yǎng)基中培養(yǎng)進(jìn)行了搖瓶條件優(yōu)化以及5L發(fā)酵罐的發(fā)酵條件優(yōu)化。同時(shí),對(duì)突變菌株與原始菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析以闡述突變株的耐受機(jī)制。最后,為獲得新的功能性化合物,對(duì)裂殖壺菌的胞外產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化以及結(jié)構(gòu)鑒定。本文建立了甘蔗渣水解液平板馴化以及ARTP誘變后利用水解液平板作為篩選培養(yǎng)基的方法。通過(guò)甘蔗渣水解液平板自然馴化獲得突變株Aurantiochytrium sp.FN-21,以葡萄糖為碳源培養(yǎng)時(shí),DHA的產(chǎn)量由5.38 g/L提高到了6.5 g/L,提高了20.8%,甘蔗渣水解液培養(yǎng)時(shí),DHA產(chǎn)量由1.23 g/L提高到了2.46 g/L,提高了 100%。通過(guò)ARTP誘變獲得突變株Aurantiochytrium sp.FNA8,DHA產(chǎn)量由5.38 g/L提高到了 6.56 g/L,產(chǎn)量提高了 21.9%,甘蔗渣水解液培養(yǎng)時(shí)由1.23 g/L提高到了2.36 g/L,提高了91.9%。為了進(jìn)一步提高DHA的產(chǎn)量,進(jìn)行了氮源的優(yōu)化,確定了以Aurantioc-hytrium sp.FNA8為出發(fā)菌株在甘蔗渣水解液添加22 g/L的玉米漿粉,最終DHA的產(chǎn)量達(dá)到了5.08 g/L。最后,利用5 L罐上進(jìn)行驗(yàn)證及進(jìn)一步優(yōu)化,以稀釋一倍的水解液作為初始培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后補(bǔ)料發(fā)酵,最終DHA產(chǎn)量達(dá)到了 8.63 g/L。裂殖壺菌利用纖維素水解液生產(chǎn)DHA具有很高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本文對(duì)突變株Aurantiochtrium sp.FN21和原始菌株Aurantiochytrium sp.FJU-5-12在水解液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期和對(duì)數(shù)期的菌取樣測(cè)序,進(jìn)行RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)在TCA循環(huán)、氨基酸的生物合成、脂肪酸代謝和芳香族化合物的降解等四個(gè)代謝過(guò)程中的一些基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著上調(diào),分析這些途徑可能與Aurantio chytrium sp.FN21的纖維素水解液耐受性有關(guān)。選取無(wú)蛋白胨、酵母膏的培養(yǎng)基進(jìn)行裂殖壺菌的200 L罐發(fā)酵,發(fā)酵液通過(guò)離心、萃取獲得了9g粗提液。粗提液利用正相硅膠柱、反向硅膠柱和凝膠柱進(jìn)行分離,最終獲得5種化合物。利用質(zhì)譜進(jìn)行物質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析和鑒定。選取其中一種可能具有研究?jī)r(jià)值的甾醇類進(jìn)行1H譜和13C NMR譜等推測(cè)該化合物為(E-17-(5-ethly-6-methylhept-3-en-2-ly)-10,13-dimethyl-1,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-do-decahydro-2H-5,8-epidloxycyclopenta[a]phenanthren-3-ol。該化合物分子式為 C29H46O3,分子量442.67,是海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中有價(jià)值的一種甾醇。
【學(xué)位單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ929
【部分圖文】：

?福建師范大學(xué)碩士學(xué)位論文???菌種的改造和發(fā)酵條件的優(yōu)化是提高微生物中目標(biāo)產(chǎn)物較為常用的方法，菌種??的改造主要集中在傳統(tǒng)的誘變以及對(duì)菌株進(jìn)行基因工程的改造方面。許永等利用紫??外誘變結(jié)合喹禾靈篩選的方法使裂殖壺菌種ＤＨＡ的產(chǎn)量提高了?１３．４％１＠。由于裂??殖壺菌是真菌，基因工程改造存在一定的難度，目前通過(guò)基因工程改造裂殖壺菌的??報(bào)道較少。Ｘｉａｏｙａｎ?Ｚｈｕａｎｇ等利用電轉(zhuǎn)將Ｇ４１８抗性和ｂｌｅ基因成功導(dǎo)入裂殖壺菌中，??但ＤＨＡ產(chǎn)量未明顯改變＿。發(fā)酵后期低Ｃ／Ｎ比、低溫、低轉(zhuǎn)速均有利于ＤＨＡ的??產(chǎn)生，因此裂殖壺菌發(fā)酵條件的優(yōu)化主要集中在前期碳源持續(xù)的供給、后期氮源的??持續(xù)補(bǔ)加、后期低溫和低轉(zhuǎn)速等方面［３１１。??

經(jīng)過(guò)一系列的還原、縮合反應(yīng)生成棕櫚酸（Ｃ１６：?０），棕櫚酸在一系列的延長(zhǎng)酶和??去飽和酶的作用下生成ＤＨＡ。而細(xì)菌等原核生物中的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸通常采用??厭氧聚酮合酶（ＰＫＳ）途徑合成１２８］。如圖３所示，脂酰－ＡＣＰ和丙二酸單酰－ＡＣＰ在??厭氧條件下經(jīng)過(guò)一系列的縮合，加氫，還原，脫氫等反應(yīng)最后生成ＤＨＡ。本文以裂??殖壺菌作為ＤＨＡ發(fā)酵菌株，一般認(rèn)為裂殖壺菌中ＤＨＡ和ＤＰＡ由ＰＫＳ途徑合成，??而其他的短鏈脂肪酸由ＦＡＳ途徑合成％。陳偉等利用了淺藍(lán)菌素對(duì)ＦＡＳ途徑的不??可逆抑制，分別在甘油和葡萄糖中培養(yǎng)，確定了裂殖壺菌中存在的ＰＫＳ和ＦＡＳ途??徑均可以合成ＤＨＡｔ２７］。??１．４裂殖壺菌中ＤＨＡ產(chǎn)量的優(yōu)化??－３－??

以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)微生物油脂的生物煉制技術(shù)??隨著社會(huì)的發(fā)展，石油、天然氣和煤等化石資源的大量開采用于制備燃料和品。導(dǎo)致自然資源消耗殆盡，環(huán)境污染難以治理，所以發(fā)展可再生的能保護(hù)環(huán)新能源迫在眉睫１３２］。木質(zhì)纖維素來(lái)源豐富，分布廣泛，價(jià)格低廉，生成過(guò)程中收Ｃ〇２有利于保護(hù)環(huán)境。所以木質(zhì)纖維素的利用和開發(fā)來(lái)代替化石能源獲得了的關(guān)注。??２．１木質(zhì)纖維素??木質(zhì)纖維素主要由木質(zhì)素，纖維素和半纖維素組成，一般來(lái)說(shuō)纖維素比０％－６０％、半纖維素為２０％－４０％、木質(zhì)素為１５％－２５％，還有少量的灰分、礦物構(gòu)蛋白等物質(zhì)［３３１。木質(zhì)纖維素的種類眾多，如下圖四所示：有甘蔗渣，玉米棒稻草秸桿等１Ｗ。??
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