發(fā)布時(shí)間：2020-10-19 10:28

　　 牡丹籽油(peony seed oil,PSO)屬于新食品資源,被專家評(píng)為優(yōu)質(zhì)食用油,是從牡丹籽中提煉的金黃色透明液態(tài)油。不飽和脂肪酸是PSO中最重要的活性成分,其中亞麻酸的含量所占比例為60%。研究表明PSO具有許多生理功能,最近研究顯示PSO可能具有抗炎生物活性,但其具體抗炎功能分子機(jī)制尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究利用細(xì)胞和動(dòng)物炎癥模型:葡聚糖硫酸鈉(sodium dextran sulfate,DSS)誘導(dǎo)ICR小鼠構(gòu)建體內(nèi)炎癥模型和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞構(gòu)成體外炎癥模型,共同對(duì)PSO抗炎功能進(jìn)行評(píng)估及對(duì)抗炎作用的分子機(jī)理進(jìn)行初步探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為牡丹籽深加工及牡丹籽油保健食品的開(kāi)發(fā)提供參考。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn):PSO干預(yù)組小鼠比DSS組精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn),便稀、便血小鼠數(shù)量減少或無(wú),結(jié)直腸病變程度減輕,疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)評(píng)分降低趨勢(shì)顯著。使用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylineosin staining,HE)檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織病變情況,顯微鏡下采集圖片分析比較可知,DSS組小鼠病變情況如下:黏膜大面積糜爛,腺體隱窩結(jié)構(gòu)完整性破壞較嚴(yán)重,有大量的炎性細(xì)胞如淋巴細(xì)胞及伴中性粒細(xì)胞等浸潤(rùn),杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少,呈現(xiàn)出潰瘍性結(jié)腸炎癥狀;而PSO干預(yù)組小鼠結(jié)腸出血較少,炎性細(xì)胞有少量浸潤(rùn),結(jié)腸黏膜糜爛狀況減輕,隱窩結(jié)構(gòu)排列較為整齊、形態(tài)較為完整。通過(guò)測(cè)定小鼠血漿中組織損傷因子髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA),發(fā)現(xiàn)DSS組中MPO和MDA和分別升高為對(duì)照組的3.5和3.2倍。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸組織損傷炎癥介質(zhì)一氧化氮(nitrite/nitrate,NO)含量升高了4.2倍;相比于DSS組,PSO組MPO、MDA和NO含量分別降低了 20%、26%和22%。從生化指標(biāo)的角度,發(fā)現(xiàn)PSO能減少DSS誘導(dǎo)的小鼠損傷。熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(westernblotting,WB)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,DSS組小鼠結(jié)腸組織中環(huán)氧化合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-lβ,IL-1β)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的mRNA表達(dá)水平顯著升高,而PSO組相比于DSS組分別下降53.6%、41.0%、50.6%和54.2%。WB實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這些炎性細(xì)胞因子蛋白質(zhì)表達(dá)水平有相似結(jié)果。檢測(cè)結(jié)腸組織中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信號(hào)通路關(guān)鍵靶基因的磷酸化表達(dá)情況。DSS組細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 的磷酸化(phosphorylation of extracellular regulated protein kinases1/2、p-ERK1/2)、c-Jun 氨基末端激酶的磷酸化(phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)和p-p38蛋白質(zhì)表達(dá)量為對(duì)照組的 1.48±0.23、1.88±0.24、3.21±0.45倍。PSO組分別為對(duì)照組的 1.23±0.15、1.45±0.25和1.48±0.34倍。結(jié)果顯示PSO能抑制MAPK信號(hào)通路的活化,可能與其抑制炎癥因子表達(dá)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中通過(guò)噻唑蘭(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe nyltetrazolium bromide,MTS)法檢測(cè)PSO對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性影響。結(jié)果顯示PSO各組與對(duì)照組OD值無(wú)明顯差異。說(shuō)明0～400μg/mLPSO溶液對(duì)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)、狀態(tài)及活力無(wú)影響,證明對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。LPS組細(xì)胞COX-2、TNF-α、IL-1β和iNOS炎癥因子mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的5.66、7.59、6.78和2.62倍;而PSO 25 μg/mL、50 μg/mL和 100 μg/mL三組與LPS組相比,均呈劑量依賴性顯著降低。蛋白表達(dá)量有相似結(jié)果。采用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)炎性細(xì)胞中炎癥相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性。相比于對(duì)照組,LPS模型組細(xì)胞AP-1/c-Jun(activatorprotein-1)與NF-κB/p65(nuclear transcription factor-κB)相對(duì)熒光素酶活性(RLU)分別增加了 1.89倍和2.22倍,而PSO各組細(xì)胞中AP-1與NF-κB的RLU值呈劑量依賴性減少,分別減少了 32.3%、39.2%、47.1%和36.9%、43.7%、55.4%。c-Jun和p65蛋白在胞漿與胞核中的變化情況如下:相比于對(duì)照組,LPS組胞核與胞漿中c-Jun和p65蛋白表達(dá)量趨勢(shì)相反,在胞核中均增加,而胞漿中均下降;相比于LPS組細(xì)胞,PSO組胞核中和胞漿中c-Jun蛋白表達(dá)量逐漸增加,而p65蛋白表達(dá)量顯著降低,且呈劑量依賴性。因此,PSO可顯著抑制炎癥細(xì)胞胞漿胞核中c-Jun、p65的移位作用,可使AP-1、NF-κB轉(zhuǎn)錄活性降低。對(duì)細(xì)胞中MAPKs通路關(guān)鍵靶基因的磷酸化激活水平的檢測(cè),結(jié)果表明PSO組p-ERK1/2、p-JNK、p-p38蛋白表達(dá)量相比LPS組下降,說(shuō)明PSO可能通過(guò)調(diào)節(jié)MAPKs關(guān)鍵靶基因磷酸化的激活抑制炎癥的產(chǎn)生。LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中,加入MAPKs通路靶基因的抑制劑處理,利用WB技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中促炎因子IL-1β表達(dá)量,以及MAPKs關(guān)鍵靶基因的磷酸化激活情況。由結(jié)果可知,與LPS誘導(dǎo)組相比,在PSO與MAPKs抑制劑共同作用下,細(xì)胞中炎癥因子IL-1β表達(dá)水平及MAPKs關(guān)鍵靶基因中p-ERK1/2、p-JNK、p-p38的蛋白表達(dá)水平顯著減少。說(shuō)明在MAPK磷酸化作用被阻斷的情況下,PSO可與抑制劑發(fā)生協(xié)同作用抑制炎癥因子的表達(dá)從而發(fā)揮抗炎功效。綜上所述可知,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,從動(dòng)物整體水平上PSO能有效改善DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎癥的宏觀表型,降低DAI,緩解結(jié)腸組織病理?yè)p傷;降低結(jié)腸組織中MPO、MDA含量和血清中NO含量;抑制結(jié)腸組織中COX-2、TNF-α、IL-1β和iNOS等促炎基因的高表達(dá);減少結(jié)腸組織中p38、JNK及ERK1/2的磷酸化水平。在體外實(shí)驗(yàn)中,從細(xì)胞整體水平上PSO可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子COX-2、TNF-α、IL-1β和iNOS基因的過(guò)表達(dá);抑制炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB、AP-1)在胞漿胞核間的變化情況及轉(zhuǎn)錄活性;減少M(fèi)APKs中p38、JNK及ERK1/2的磷酸化程度。另外,在PSO存在的情況下,添加MAPKs抑制劑可進(jìn)一步抑制MAPKs中p38、JNK及ERK1/2磷酸化水平以及炎癥因子IL-1β的表達(dá)。提示PSO抗炎機(jī)理的分子機(jī)制,與通過(guò)抑制結(jié)腸組織和細(xì)胞中MAPKs信號(hào)通路,以及抑制細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子從而減少炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：中南林業(yè)科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS221
【部分圖文】：

癥模型。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察小鼠并在指定的時(shí)間點(diǎn)記錄總的自由飲用２．０％ＤＳＳ水溶液后，前幾日每組間小鼠的狀態(tài)無(wú)顯天，ＤＳＳ損傷組小鼠表現(xiàn)出體重減輕、精神萎靡、食物和水少、便稀甚至便血和其他典型的ＩＢＤ樣結(jié)腸炎癥狀。初步判功。牡丹籽油灌胃組（５００ｍｇ／ｋｇ／天）的ＤＳＳ誘導(dǎo)的小鼠以上顯減輕。飲用ＤＳＳ水至第６天時(shí)，ＤＳＳ損傷組體重從３５．７７?±?０?±?１．０８?ｇ，而對(duì)照組和牡丹籽油保護(hù)組的小鼠體重均處于緩第九天，牡丹籽油灌胃組的ＤＳＳ誘導(dǎo)小鼠體重出現(xiàn)便稀現(xiàn)象，現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組間小鼠的平均體重情：３９．０４?±０．６５?ｇ，?ＤＳＳ?組：３０．２３?±０．５８?ｇ，?ＰＳＯ?保護(hù)組：３３．４４?保護(hù)組小鼠體重與ＤＳＳ損傷組呈現(xiàn)顯著性差異。０＜〇．〇５、戶＜４５．０??

Ｔｉｉｎｅ（ｄ）??時(shí)間（天）??圖２－２?ＤＳＳ誘導(dǎo)結(jié)腸炎ＤＡＩ評(píng)分??Ｆｉｇ．?２－２?ＤＡＩ?ｓｃｏｒｅ?ｉｎ?ＤＳＳ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｃｏｌｉｔｉｓ?ａｍｏｎｇ?ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ?ｇｒｏｕｐｓ??注：與ＤＳＳ組比較，＊戶＜?０．０５??實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，ＤＳＳ組中９５％的小鼠具有不同程度的腹瀉，保護(hù)組降低至７５％??（圖?２－３）。??＊本??Ｉ?Ｉ??１００?ｒ??９０．?閱??８０?ＸＸ＼??＾?７０?ＸＸＸ?冃??ｓｉ６０?ｔｖ?ｍ??ｉｆ?Ｓ?＂°?ＩＩＩ?—??睞?４０?ｔｔｉ?＝??鵯?＾?３。?ｘｖ?ｍ??２０?Ｘｉｉ?＝??１０?ｔｔｉ??ｏ＇?＾??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＤＳＳ?ＤＳＳ＋ＰＳＯ??圖２－３小鼠腹瀉率??Ｆｉｇ．?２－３?Ｄｉａｒｒｈｅａ?ｒａｔｅ?ｏｆ?ｍｉｃｅ?ａｍｏｎｇ?ｔｈｒｅｅ?ｇｒｏｕｐｓ??注：與ＤＳＳ組比較，＊＊；？＜?０．０１??２６??

?＾??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＤＳＳ?ＤＳＳ＋ＰＳＯ??圖２－３小鼠腹瀉率??Ｆｉｇ．?２－３?Ｄｉａｒｒｈｅａ?ｒａｔｅ?ｏｆ?ｍｉｃｅ?ａｍｏｎｇ?ｔｈｒｅｅ?ｇｒｏｕｐｓ??注：與ＤＳＳ組比較，＊＊；？＜?０．０１??２６??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2847087