發(fā)布時間：2020-10-21 07:37

　　 食用蕈菌味道鮮美,營養(yǎng)價值豐富,開發(fā)和利用野生食用蕈菌資源,對豐富野生食用蕈菌種質資源庫意義重大,是蕈菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關鍵。本課題運用形態(tài)學觀察結合內轉錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer,ITS)基因測序的方法對野外采集到的疑似野生馬鞍菌X1菌株進行了分類鑒定;測定了該菌子實體的主要營養(yǎng)成分;采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry,ICP-AES)對其子實體礦物質進行了檢測;采用氣相色譜-質譜(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)聯(lián)用技術對其子實體揮發(fā)性成分進行了定性和定量分析;以DPPH·和ABTS~+·清除能力為指標,以BHT作為陽性對照,測定了子實體粗多糖的體外抗氧化活性;對其子實體粗提物進行了急性毒理試驗;在此基礎上,對其菌絲體的生物學特性進行了探究,設計了人工栽培試驗;并采用Illumina Miseq高通量測序技術對該菌子實體根際土壤真菌群落組成及多樣性進行了分析;最后對其菌絲體進行了液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵研究。主要研究結果如下:(1)運用形態(tài)學觀察與分子生物學技術相結合的方法,確定了X1菌株的分類地位。結果顯示:X1菌株隸屬子囊菌門(Ascomyzcota)盤菌綱(Pezizomycetes)盤菌目(Pezizales)馬鞍菌科(Helvellaceae)馬鞍菌屬(Helvella),拉丁文學名為Helvella lacunosa,中文名稱為棱柄馬鞍菌,異名多洼馬鞍菌。(2)對棱柄馬鞍菌子實體的主要營養(yǎng)成分進行了測定,結果表明:該菌子實體粗蛋白含量達23.72%,粗脂肪含量達3.65%,粗纖維含量達55.12%;子實體中共檢測到17種氨基酸,包括人體所必需的8種氨基酸,必需氨基酸含量是非必需氨基酸含量的0.64倍,且鮮味氨基酸(Asp、Glu、Gly和Ala)占氨基酸總量的30.07%;采用ICP-AES法對子實體的16種礦質元素進行了檢測,結果表明:子實體含有豐富的礦質元素,其中Fe、Zn、K、Na、Ca、Mn、Cu及Mg的含量分別為0.114μg/g、0.017μg/g、2.13μg/g、0.13μg/g、0.0046μg/g、0.0053μg/g、0.0032μg/g、0.1005μg/g,重金屬只檢出As和Sb,含量分別為0.0021μg/g和0.0013μg/g,均低于國家食品標準規(guī)定的0.1μg/g的限量要求;采用GC-MS法對子實體的揮發(fā)性成分進行分析,共檢測到122種化合物,確定結構39種,占總揮發(fā)性成分的81.5%,其中相對含量較高的己醛、己酸、乙酸和2-戊基呋喃是國家規(guī)定允許使用的食用香料,是調香原料不可缺少的物質;以DPPH·和ABTS~+·清除能力為指標,測定了子實體粗多糖的體外抗氧化活性,結果表明:該菌子實體粗多糖具有較強的抗氧化性,當濃度為10mg/mL時,對DPPH·和ABTS~+·的清除率分別達到49.18%和53.33%;由子實體粗提物急性毒理試驗結果可知,用藥組最大給藥劑量達0.4mL/10g.bw時,實驗小鼠生存狀況良好,未出現(xiàn)明顯的致毒反應,且14d內實驗小鼠全部存活,處死解剖后的小鼠臟腑器官未見明顯的病理改變。根據(jù)食品安全國家標準,可以認定棱柄馬鞍菌是安全無毒的。由此可見,該野生菌不但營養(yǎng)豐富,味道鮮美,且無毒性,是一種值得開發(fā)利用的蕈菌。(3)以PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,利用平板培養(yǎng)的方法初步研究了X1菌株的生物學特性,研究結果表明:X1菌株菌絲體生長的最佳碳源為葡萄糖、氮源為酵母浸膏、無機鹽為MgSO_4;最佳培養(yǎng)溫度為25℃,適宜pH為6.5,適宜光照條件為12h黑暗+12h光照。人工栽培X1菌株試驗結果表明:X1菌株最適宜的原種培養(yǎng)基為松木屑+麩皮煮汁瓊脂培養(yǎng)基;最佳母種培養(yǎng)基為松木屑+麥粒培養(yǎng)基;最適宜的栽培料配方是松木屑+棉籽殼,X1菌絲體在該培養(yǎng)料上長勢好,65d滿袋,平均生長速度達4.32±1.54mm/d,子實體直徑0.3–1.6cm,菌蓋淡褐色,菌柄灰白色,其長度、直徑分別達0.3–3.12cm和0.5–1.5cm;子實體產(chǎn)量和生物學效率分別為23.24g/袋和4.56%。(4)采用Illumina MiSeq高通量測序技術結合生物信息學對棱柄馬鞍菌子實體根際土壤真菌群落組成及多樣性進行了分析,結果表明:5個樣本之間共有分類操作單元(Operational Taxonomic Unit,OTU)182個,樣本5中特有OTU最多,為201個,樣本1中特有OTU最少,僅59個。樣本5和樣本2種群豐度高于其余3個樣本(P0.05)。樣本1中特有的真菌屬有Halokirschsteiniothelia;樣本2中特有的真菌屬有Plectania、Heydenia、Trichosporon、Clavaria,Thelonectria、Leucoglossum、Lepiota、Tricholoma;樣本3中特有的真菌屬有Metarhizium、Ceratocystis、Cadophora、Cercophora、Podospora;樣本4中特有的真菌屬有Hypxylon、Physciella、Cyphellophora、Phyragmocephala、Alternaria、Guttulispora、Ophiostoma、Tomentella、Caluatia、Thermomyces、Auxarthron、Botrytis、Scleromitrula、Schizothecium、Chaetomium、Glomerella、Acremonium、Cosllarina;樣本5中特有的真菌屬有Hirsutella、Porormia、Pseudodictyosporium、Lophiotrema。5個樣本中優(yōu)勢菌群均屬于子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomycota),以上菌群在5個樣本中的分布存在差異,但相對含量均大于5%。本實驗結果說明,不同采樣地棱柄馬鞍菌根際土壤真菌多樣性和物種豐度差異明顯(P0.05),沒有子實體生長的土壤,其真菌多樣性高于生長過棱柄馬鞍菌的土壤,且不同土壤樣本中優(yōu)勢菌屬種類與豐度不一樣,可見棱柄馬鞍菌對于根際定殖真菌具有一定選擇性。(5)以液態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基為對照,以菌絲體生物量和胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)含量作為評價指標,通過單因素試驗與響應面法對X1菌株液體搖瓶發(fā)酵過程中最適碳氮源以及添加量進行了優(yōu)化。研究結果表明,當發(fā)酵配方為:1000mL馬鈴薯和松針煮汁、28.58g葡萄糖、2.77g蛋白胨、3.01g酵母浸膏、1g KH_2PO_4、1g NaHCO_3、0.5g MgSO_4和0.01g維生素B_1時,X1菌株的菌絲體生物量最高,可達11.01g/L,是對照組的8.83倍;當發(fā)酵配方為:1000mL馬鈴薯和松針煮汁、28.49g/L葡萄糖、3.54g蛋白胨、3.85g酵母浸膏、1g KH_2PO_4、0.5g MgSO_4和0.01g維生素B_1時,EPS含量最高,可達233.25mg/L,是對照組的4.06倍。在此基礎上,采用正交試驗對其菌絲體液態(tài)培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,得出X1菌株的最佳液態(tài)培養(yǎng)條件為:接種量20%,裝液量80mL,轉速140r/min。經(jīng)驗證試驗得出,在優(yōu)化后的發(fā)酵工藝下,X1菌株的菌絲體生物量和EPS含量可高達11.86g/L和244.56mg/L,分別是對照組的9.59和4.31倍。(6)以X1菌株為發(fā)酵菌株,以山西常見的10種谷物(小麥、大米、燕麥、玉米、小米、藜麥、蕎麥、大豆、豌豆和高粱)為發(fā)酵基質,對比研究了X1菌株通過固態(tài)發(fā)酵對發(fā)酵基質總酚含量和抗氧化性能的影響。結果表明,經(jīng)X1菌株固態(tài)發(fā)酵后,小米、燕麥、藜麥、小麥和大豆發(fā)酵產(chǎn)物的總酚含量與發(fā)酵時間呈現(xiàn)出較顯著的正相關性,相關系數(shù)(R)分別為0.930、0.898、0.911、0.764和0.770。發(fā)酵35d后,5種發(fā)酵谷物的總酚含量達到最大值:3.38mg/g、3.30mg/g、1.30mg/g、3.06mg/g和0.57mg/g,分別比對照高1.57、2.21、1.86、2.03和1.10倍。大米、蕎麥和豌豆發(fā)酵產(chǎn)物的總酚含量與發(fā)酵時間呈正相關(R分別為0.435、0.398和0.132);玉米和高粱發(fā)酵產(chǎn)物的總酚含量與發(fā)酵時間呈負相關(R=-0.399和-0.723)。發(fā)酵7d后,玉米發(fā)酵產(chǎn)物總酚含量的最大值為3.18mg/g,比對照低0.3%;高粱發(fā)酵產(chǎn)物的總酚含量最大值為2.68mg/g,比對照低12%。以DPPH·清除能力、還原力、O_2~-·清除能力和Fe~(2+)螯合能力為指標,對發(fā)酵產(chǎn)物進行體外抗氧化性能分析,結果表明,10種谷物發(fā)酵產(chǎn)物中,小麥發(fā)酵產(chǎn)物提取物的DPPH·清除能力最強,EC_(50)值為0.16mg/mL,比對照組降低了98.78%;豌豆發(fā)酵產(chǎn)物提取物的還原力最強,EC_(50)值為4.18mg/mL,比對照組降低了56.56%;小米發(fā)酵產(chǎn)物提取物的Fe~(2+)螯合能力最強,EC_(50)值達16.64mg/mL,比對照組降低了81.61%;高粱發(fā)酵產(chǎn)物提取物的O_2~-·清除能力最強,EC_(50)值為12.41mg/mL,比對照組降低了53.82%。本實驗結果表明,X1菌株固態(tài)發(fā)酵可以有效改善發(fā)酵基質的總酚含量和抗氧化性能。本研究結果表明,棱柄馬鞍菌不僅子實體營養(yǎng)豐富,含有多種氨基酸和微量元素,其菌絲體的固態(tài)發(fā)酵還可以有效改善發(fā)酵基質的抗氧化性能,因而,本研究既可以為開發(fā)利用棱柄馬鞍菌菌株提供理論依據(jù),還可以為開發(fā)谷物抗氧化產(chǎn)品或功能食品提供科學指導。
【學位單位】：山西大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S646.11;TQ920.6;TS219
【部分圖文】：

分類上絕大多數(shù)屬于擔子菌門，如雙孢蘑菇（Agaricudodes）和黑木耳（Auricularia auricula）等；少數(shù)屬于子lla esculenta）、蛹蟲草（Cordyceps militaris）和馬鞍菌（H子實體由兩部分組成，分別是菌蓋和菌柄，如圖 1.1 所

圖 1.3 蕈菌 rDNA 的結構[33]Fig 1.3 The structure of rDNA in mushroomsParnmen 等[36]采用 ITS 鑒定法對冷凍干燥的蕈菌子實體進行了分類鑒定。

圖 1.4 中國馴化的野生食藥用菌數(shù)量在世界總量中所占的比例Fig 1.4 The proportion of wild edible and medical fungus domesticated of China in the World中國地大物博，蕈菌數(shù)量更是遙居世界首位，但已經(jīng)實現(xiàn)人工栽培的種類僅占
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本文編號：2849837