發(fā)布時(shí)間：2020-10-23 09:54

　　 作為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),γ-氨基丁酸(GABA)具有降血壓、健肝利腎、增強(qiáng)記憶、促進(jìn)睡眠等多種生理功能,在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)具有廣泛用途。通過乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA以滿足其日益增長(zhǎng)的商業(yè)需求是人們的普遍共識(shí),了解乳酸菌谷氨酸脫羧酶(GAD)系統(tǒng)基因表達(dá)情況,并通過代謝工程、蛋白質(zhì)工程和發(fā)酵調(diào)控等手段提升乳酸菌GABA生產(chǎn)性能具有重要意義。本研究首先以GABA高產(chǎn)菌株Lactobacilaus bbrevis CGMCC1306為研究對(duì)象,解析了在不同培養(yǎng)條件下菌株GAD系統(tǒng)關(guān)鍵基因的表達(dá)差異;其次,克隆了植物乳桿菌Lactobacillus plantarum GAD(具有相對(duì)較寬pH催化活性范圍)基因并對(duì)其進(jìn)行分子改造,獲得了在近中性pH條件下仍具有較高催化活性的突變體GadBC378S,并將該突變酶在Lb.brevis CGMCC1306中過表達(dá),提高了菌株的GABA合成能力。論文主要研究結(jié)果如下:(1)以Lb.brevisCGMCC1306為研究對(duì)象,在外源添加二環(huán)己基碳二亞胺(DCCD)弱化細(xì)胞F1Fo-ATPase酶活的情況下,考察菌體生長(zhǎng)代謝情況和其GAD系統(tǒng)中關(guān)鍵基因gadA、gadB和gadC的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明:不同程度弱化F1Fo-ATPase活性會(huì)導(dǎo)致該菌菌體生長(zhǎng)受到不同程度的抑制,且高濃度DCCD會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡;采用低濃度的DCCD適當(dāng)抑制F1Fo-ATPase酶活可以加快Lb.brevisCGMCC1306在兼性厭氧條件下細(xì)胞內(nèi)的糖酵解速率,并提高GAD系統(tǒng)關(guān)鍵基因gadB和gadC的表達(dá)水平(對(duì)數(shù)后期時(shí)較對(duì)照組分別提高25.09%和37.65%;穩(wěn)定期時(shí)較對(duì)照組分別提高11.03%和32.5%),從而提高菌體細(xì)胞的GABA合成速率。(2)以獲取具有相對(duì)較寬pH催化活性范圍的Lb.plantarumGAD(GadB)為目標(biāo),采用溶鈣圈法和目的基因PCR篩選法獲得了兩株具有GABA合成能力的植物乳桿菌Lb.plantarum GM1403與Lb.plantarum PF1409,然后克隆了這2個(gè)菌株的gadB基因,并以pET28a表達(dá)載體,分別在E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行了重組表達(dá)研究,實(shí)現(xiàn)了2個(gè)酶的可溶性表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,考察了這兩個(gè)酶的酶學(xué)性質(zhì),發(fā)現(xiàn)兩種酶最適溫度和pH相同(分別為40 ℃和pH 5.0),但是來源于這兩個(gè)菌株的GadB具有更寬廣的pH催化范圍:當(dāng)pH值升高至5.6時(shí),不僅仍具有催化活性,而且相對(duì)酶活高達(dá)34.5%,遠(yuǎn)高于其它乳酸菌源的GAD相對(duì)酶活。(3)為進(jìn)一步提高Lb.plantarum GM1403 GadB在中性條件下的催化活力,本研究構(gòu)建了截短C末端的GadB△11突變體并通過定向進(jìn)化的方法獲得了該突變體的突變文庫(kù),利用建立的高通量篩選法(基于pH敏感指示劑甲酚紅的比色法),在近中性條件下篩選獲得了一個(gè)較好的突變體C378S:該突變體在pH值為6和7時(shí),酶活性分別是GadB△11的1.48倍和2.03倍。在最適反應(yīng)條件下(pH 5.0,40℃,C378S 的Km 為 19.03 mM,且與 GadB△11 相似。在Lb.brevis CGMCC 1306中,利用乳酸菌組成型表達(dá)載體pMG36e對(duì)突變體C378S進(jìn)行異源過表達(dá),結(jié)果表明重組菌株Lb.brevis/pMG36e-gadBc378s經(jīng)過36 h發(fā)酵,GABA的產(chǎn)量可以達(dá)到38.47 g/L,較對(duì)照組的產(chǎn)量提升了 24%。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ921.4
【部分圖文】：

反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ＧａｄＣ將堿性物質(zhì)ＧＡＢＡ與胞外的谷氨酸交換，而Ｇｌｕ／ＧＡＢＡ的??跨膜運(yùn)輸產(chǎn)生的電勢(shì)差通過Ｆｆｏ－ＡＴＰａｓｅ可以生成一個(gè)ＡＴＰ。由此可見??Ｆｆｏ－ＡＴＰａｓｅ活性、ＧＡＤ活性、質(zhì)子環(huán)境變化之間存在著緊密聯(lián)系（圖２．１）。??課題組前期研究表明，氧氣是影響乳酸菌ＧＡＢＡ合成效率的關(guān)鍵因素；且??在兼性厭氧條件下，一定程度上弱化Ｆｆｏ－ＡＴＰａｓｅ活性可以促進(jìn)乳酸菌細(xì)胞ＧＡＤ??活性的提升［１００］，但該過程對(duì)其ＧＡＤ系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的影響尚需進(jìn)一步闡明。??短乳桿菌是乳酸菌中高產(chǎn)ＧＡＢＡ的常見菌種。通常，其ＧＡＤ系統(tǒng)含有兩個(gè)谷氨??酸脫羧酶和一個(gè)Ｇｌｕ／ＧＡＢＡ反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們的編碼基因分別被命名為職必、??和ｇａｄ，其中ｇｒｗ／Ｓ和ｇａｄＣ組成操縱子本章將以課題組從鮮牛奶??中分離得到的一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的ＧＡＢＡ高產(chǎn)菌株６ｒｅｖ＾ＣＧＭＣＣ?１３０６??為研究對(duì)象，選�。模茫茫淖鳛椋疲妫铮�ＡＴＰａｓｅ酶抑制劑，分析弱化Ｆｆｏ－ＡＴＰａｓｅ活??性對(duì)短乳桿菌的生長(zhǎng)、糖酵解的影響

圖２．６?ＤＣＣＤ對(duì)短乳桿菌生長(zhǎng)的半數(shù)效應(yīng)濃度測(cè)定??Ｆｉｇ?２．６?ＥＣ５０?ｏｆ?ＤＣＣＤ?ｔｏ?ｔｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ?Ｌｂ．?ｂｒｅｖｉｓ?ＣＧＭＣＣ１３０６??單位時(shí)間單位菌體消耗的葡荀糖量如圖２．７所示。研究表明：葡荀糖代謝速??率隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)時(shí)期延長(zhǎng)而逐漸降低，這與不同時(shí)期細(xì)胞的生理活性相符合；??值得關(guān)注的是，相比于對(duì)照組，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（ＥＸＰ．；?１８?ｈ?）、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期（ＥＸＲ；??２４?ｈ）加入０．１７?ｍＭ?ＤＣＣＤ體系中的加ｅｖｋ?ＣＧＭＣＣ?１３０６細(xì)胞的葡萄糖代謝??速率分別增加４６．６７?％、１３?％；同時(shí)平衡期（ＳＴＡＴ．；?３０?ｈ）對(duì)照組體系中Ｚｒｏｖｂ??ＣＧＭＣＣ?１３０６細(xì)胞葡萄糖代謝十分微弱，而加入ＤＣＣＤ后菌體細(xì)胞葡萄糖代謝??明顯活躍。這可能是弱化ＦｉＦｏ－ＡＴＰａｓｅ活性導(dǎo)致胞內(nèi)ＡＴＰ水平降低，減少了?ＡＴＰ??對(duì)糖酵解中關(guān)鍵酶的抑制，且細(xì)胞為維持生理活性進(jìn)而加速糖酵解途徑從而獲得??相應(yīng)的ＡＴＰ供給，因而有效促進(jìn)了糖酵解通量的增加。?＿??Ｓ?１０－１???ｔ．?Ｊ?［Ｚ＾?ＣＫ??藝?８－?■?■■?０．１７?ｍＭ?ＤＣＣＤ??＾?ｊ??■??！?Ｉ?ｉ?ｊ??１?Ｈ?．．．．．．Ｍ?Ｌ－Ｐ?－??＾?ＥＸＰ．；?１８?ｈ?ＥＸＰ．；?２４?ｈ?ＳＴＡＴ．；?３０?ｈ??ｏ??圖２．７兼性厭氧條件下ＤＣＣＤ對(duì)短乳桿菌葡萄糖代謝的影響??Ｆｉｇ?２．７?Ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ＤＣＣＤ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ?ｆｌｕｘ?ｏｆ?Ｌｂ．ｂ

菌株ＧＭ４０３與ＺＡ?ＰＦ１４０９由本章篩選、鑒定并保??藏；載體ｐＥＴ２８ａ（＋），質(zhì)粒圖譜如圖３．１，質(zhì)粒全長(zhǎng)為５３６９ｂｐ，具有卡那霉素抗??性。菌株克隆宿主Ｚ?ｃｏ／／ＤＨ５ｃｔ及表達(dá)宿主五．ｃｏ／ｉＢＬ２１（ＤＥ３）為本實(shí)驗(yàn)室保存；??氨基丁酸（ＧＡＢＡ）標(biāo)準(zhǔn)品、谷氨酸鈉、酵母粉、胰蛋白胨、氯化鈉、丹酰??氯（ＤＮＳ－Ｃ１）、溶菌酶、５〇ｘＴＡＥ緩沖液、硫酸卡那霉素（Ｋａｎ）、異丙基－ｐ－Ｄ－??硫代吡喃半乳糖苷（ＩＰＴＧ）、質(zhì)粒提取試劑盒、ＰＣＲ產(chǎn)物純化試劑盒、ＤＮＡ瓊??脂糖凝膠回收試劑盒及超級(jí)感受態(tài)制備試劑盒購(gòu)自上海生工；細(xì)菌基因組抽提試??劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司（中國(guó)）；甲醇（色譜純）購(gòu)自Ｔｅｄｉａ公司；Ｔ４ＤＮＡ??快速連接酶購(gòu)于北界全式金生物技術(shù)有限公司；ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ？Ｍａｘ??ＤＮＡ聚合酶及蛋白Ｍａｒｋｅｒ購(gòu)自Ｔａｋａｒａ公司；限制性內(nèi)切酶；Ｓｈ／?Ｉ和Ｉ購(gòu)??自美國(guó)Ｔｈｅｒｍｏ公司；Ｎｉ－ＮＴＡ?Ａｇａｒｏｓｅ購(gòu)自Ｑｉａｇｅｎ；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。??Ｘｈｏ?ｌ｜１Ｓ８｝??Ｎｏｔ??Ｅａｇ?ｌ＂６６）??Ｈ？ｎｄ?ＩＩ（＜１７３）??Ｓａｌ??Ｓａｃ?Ｉ＜１９０）??ＥｃｏＲ?１１１９２）??ＢａｍＨ?Ｉｆｉｓａ）??，Ｂｐｕ１１０２１（８０）?Ｋ２３１｝??ｏｒａ?、?Ｌｒ＾＜＾?ｎＳＵＳＳ??１（３３５）??Ｓｐ＊１?＇ｆ５？８）??＼＼??—微?＼＼＾？，，功??Ｎｒｕ?ｆ（４０８３）?ｊ?１１?ｉＢｓ￡Ｅ?ｌｉ〇３〇４）??Ｖ?，（”?｜?卜，??＼?＇ｗ／ｆ／ＢｓｓＨ）ｌ（１５？）??ＥＣ０５７Ｋ３７７２Ａ?／?／
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2852879