發(fā)布時間：2020-11-09 00:22

　　 蛋白質的O-甘露糖基化修飾于1 979年首次發(fā)現(xiàn)存在于哺乳動物中,而在此之前這種糖基化修飾形式被認為僅存在于真菌中。隨著近些年糖組學和糖蛋白組學的發(fā)展,科學家們發(fā)現(xiàn)O-甘露糖基化修飾廣泛存在于哺乳動物的蛋白質修飾中。目前研究表明,哺乳動物腦組織中約30%的O-聚糖為O-甘露聚糖,已經確證的O-甘露糖基化修飾的蛋白聚糖有50余種。O-甘露聚糖結構是通過甘露糖以α構型糖苷鍵連接到蛋白質絲氨酸或蘇氨酸殘基上,在此基礎上,N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)單元被引入到甘露糖的不同位點。根據GlcNAc引入位點的不同,O-甘露聚糖可分為Core M1、Core M2和Core M3 3個核心結構。在這3個核心結構的基礎上,糖鏈可以被進一步延伸,以不同的糖苷鍵形式引入半乳糖、唾液酸、巖藻糖、葡萄糖醛酸以及及磺酸化和磷酸化修飾,從而生成結構極其復雜多樣的O-甘露聚糖結構。O-甘露聚糖結構上的多樣性賦予其豐富的生物學功能。盡管有50余種O-甘露蛋白聚糖被鑒定,但是目前的研究僅集中在O-甘露糖基化修飾的α-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖(α-dystroglycan,α-DG)上。α-DG是細胞膜表面的重要組成部分,其與抗肌萎縮蛋白(dystrophin)和肌聚糖(sarcoglycan)共同組成肌營養(yǎng)不良蛋白復合物(dystrophin-glycoprotein complex,DGC),介導胞內與胞外基質的相互作用。α-DG上O-甘露糖基化修飾異常會導致各種程度不同的先天性肌營養(yǎng)不良癥(congenital muscular dystrophies,CMDs)。目前的研究還表明,O-甘露聚糖介導淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)、薩拉熱病毒(Lassa fever virus,LFV)等病毒對宿主細胞的入侵和感染,并且與腫瘤細胞的轉移和擴散有關。此外,O-甘露聚糖對神經系統(tǒng)的發(fā)育、生長、修復以及信號傳導方面都發(fā)揮重要作用。雖然Core M3 O-甘露聚糖的生物學功能已經明確,但是對于Core M1和Core M2 O-甘露聚糖的功能與生物合成途徑還知之甚少。因此,結構確定的Core M1和Core M2 O-甘露聚糖分子高效獲取具有重要的意義,其可以作為分子探針用來研究O-甘露聚糖的生物合成途徑,以及用于在分子水平上闡釋O-甘露聚糖多種生物學活性的作用機制,為糖鏈異常相關疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療提供理論依據。目前的O-甘露聚糖合成研究主要集中在結構簡單的Core M1的合成上,大多數(shù)化學合成策略都是目標分子為導向的合成策略,需要經過很多步化學保護基操作,整體收率低,而且最終只能得到一個目標分子。已報道的酶法合成多受限于酶的來源,以及催化效率低、可溶性表達困難、底物適應性差等問題。在前期工作中,本實驗室已經成功發(fā)展了一個多樣化為導向的化學酶法合成策略用于Core M1 O-甘露聚糖的合成。該方法步驟簡潔、收率高,實現(xiàn)了 6個Core M1 O-甘露聚糖的高效大量合成。在前期工作的基礎上,本論文發(fā)展了一種以化學法合成的核心結構為基礎的酶法模塊化組裝策略,首次成功合成了63個Core M1和Core M2 O-甘露聚糖結構,構建了結構復雜多樣的O-甘露聚糖化合物庫。該策略以克級化學合成的5個核心結構為基礎,通過多樣化為導向的3個酶法模塊的串聯(lián)使用,以最多4步反應步驟,成功獲得了 58個復雜O-甘露聚糖結構。本論文主要包括以下幾個方面:(1)化學合成5個O-甘露聚糖核心結構以氨基葡糖三氯乙酰亞胺酯和乳糖胺三氯乙酰亞胺酯為給體,利用C2位羥基裸露或者C2、C6位羥基裸露的丁二酮保護的甘露糖作為受體,經過一步平行糖苷化反應就可以高效獲得5個全保護O-甘露聚糖核心結構,再經過簡單、高效的脫保護操作,實現(xiàn)了 5個O-甘露聚糖核心結構的克級高效合成。(2)酶法模塊化合成Core M1 O-甘露聚糖以化學合成的Core M1 C2分支二糖為起始底物,通過3個酶法模塊的串聯(lián)使用,分別引入半乳糖、唾液酸和巖藻糖,合成了 7個Core M1 O-甘露聚糖結構Ⅲ-16～Ⅲ-21。(3)酶法模塊化合成C6分支Core M1 O-甘露聚糖以化學合成的C6分支二糖為起始底物,經過相同的3個酶法模塊化串聯(lián)使用,獲得7個C6分支的Core M1 O-甘露聚糖Ⅲ-22～111-27。(4)酶法模塊化合成對稱性Core M2 O-甘露聚糖以化學合成的C2,6分支對稱性Core M2三糖為起始底物,經過相同的3個酶法模塊串聯(lián)使用,同時在C2、C6分支引入相同的半乳糖、唾液酸以及巖藻糖,獲得7個對稱Core M2 O-甘露聚糖結構Ⅲ-28～111-33。(5)酶法模塊化組裝合成非對稱性Core M2 O-甘露聚糖分別以化學合成的兩個非對稱四糖核心結構為起始原料,通過改變酶法模塊化串聯(lián)的順序,以及利用糖基轉移酶對不同結構底物專一性的差異,合成了全部可能存在的42個非對稱性Core M2 O-甘露聚糖結構Ⅲ-34～111-73。本論文創(chuàng)新點包括以下幾個方面:(1)通過巧妙的設計,僅使用兩個通用的糖基給體和一個糖基受體,通過一釜法糖苷化和通用的脫保護基條件,實現(xiàn)了 5個O-甘露聚糖核心結構克級合成。(2)基于化學合成的5個核心結構,僅使用3個酶法組裝模塊,通過模塊的串聯(lián)使用和平行合成,以最長4步的線性步驟,在國際上首次實現(xiàn)了 O-甘露聚糖Core M1和Core M2全部63個結構的系統(tǒng)性、多樣化合成。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q55
【部分圖文】：

圖１．１哺乳動物體內常見的１０種單糖單元??Ｆｉｇ．?１．１?Ｃｏｍｍｏｎ?ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ?ｆｏｕｎｄ?ｉｎ?ｍａｍｍａｌｉａｎｓ．??哺乳動物體內糖鏈主要含有１０種單糖單元（如圖１．１）。其屮唾液酸有，乙??醜祌經氨酸（ｙＶ－ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ?ａｃｉｄ，?Ｎｅｕ５Ａｃ）?ＩＩＩ?輕乙酰祌經?Ｍ?酸??（ＶＶ－ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ?ａｃｉｄ，?Ｎｅｕ５Ｇｃ）兩種存在形式，而人體內只丫了?Ｎｅｕ５Ａｃ?型的??唾液酸。不同于核酸和蛋白質，糖鏈的合成是是非模板驅動的，每個單糖單元都??可以提供多個糖基化位點，形成的糖苷鍵有ｃｃ／ｐ構型之分，另外還會有硫酸化、??甲基化、乙酰化、磷酸化等糖基化后修飾過程，因此這些單糖單元可以形成數(shù)??量龐大的糖鏈結構（表１．１產］。??經過３０億年的生物進化，每個生物體的細胞表面都包被一層糖被，這層糖??被涵蓋重要的生物信息。例如紅細胞表面的糖鏈結構決定了血型類型（Ａ，?Ｂ，?ＡＢ，??或０型）Ｍ。在器官移植過程

?Ｇｌｕｃｕｒｕｎｉｒ?ａｃｉｄ．?ＣＩｃＡ?ｓｉ薦ａｄｄ??圖１．１哺乳動物體內常見的１０種單糖單元??Ｆｉｇ．?１．１?Ｃｏｍｍｏｎ?ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ?ｆｏｕｎｄ?ｉｎ?ｍａｍｍａｌｉａｎｓ．??哺乳動物體內糖鏈主要含有１０種單糖單元（如圖１．１）。其屮唾液酸有，乙??醜祌經氨酸（ｙＶ－ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ?ａｃｉｄ，?Ｎｅｕ５Ａｃ）?ＩＩＩ?輕乙酰祌經?Ｍ?酸??（ＶＶ－ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ?ａｃｉｄ，?Ｎｅｕ５Ｇｃ）兩種存在形式，而人體內只丫了?Ｎｅｕ５Ａｃ?型的??唾液酸。不同于核酸和蛋白質，糖鏈的合成是是非模板驅動的，每個單糖單元都??可以提供多個糖基化位點，形成的糖苷鍵有ｃｃ／ｐ構型之分，另外還會有硫酸化、??甲基化、乙酰化、磷酸化等糖基化后修飾過程，因此這些單糖單元可以形成數(shù)??量龐大的糖鏈結構（表１．１產］。??經過３０億年的生物進化，每個生物體的細胞表面都包被一層糖被，這層糖??被涵蓋重要的生物信息。例如紅細胞表面的糖鏈結構決定了血型類型（Ａ

Ｆｉｇ．?１．３?Ｃｏｍｍｏｎｌｙ?ｕｓｅｄ?ｇｌｙｃｏｓｙｌ?ｄｏｎｏｒ?ａｎｄ?ｔｈｅｉｒ?ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ?（ｉｎ?ｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ）．??柯尼希斯諾爾反應（Ｋｏｅｎｉｇｓ－Ｋｎｏｎ？反應）應川糖搞鹵代物作為給體，是??最早廣泛應用的方法，０前仍大量應用。如圖１．３所示，科學家們發(fā)展了各種類??型的離去基團（包括三氯乙酰亞胺酯、ｍ�、亚磷酸盐、磷酸盐、硫苠帰戊烯�??崳?來穩(wěn)定給體活性和提高反應收率。??化學合成寡糖還有一個關鍵點，就是正交保護基團的選擇，經常用到的保護??基團包拈芐基、砝醚基以及他們的衍生物，還有各種酸性、堿性敏感的保護基（圖??１．４）?ｗ。每個單糖上羥基保護基的選擇是合成路線能否成功的關鍵，較穩(wěn)定的保??１５??

本文編號：2875584