發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 19:17

　　 木質(zhì)纖維素是地球上儲(chǔ)量最豐富的可再生資源,其主要成分包括纖維素和各類半纖維素,如甘露聚糖和木聚糖等。通過(guò)糖苷水解酶,如纖維素酶,甘露聚糖酶和木聚糖酶催化降解,這些多糖成分可以被水解成可溶性糖,經(jīng)過(guò)生物煉制可以轉(zhuǎn)化為生物燃料和多種化工制品,這為解決當(dāng)前世界所面臨的環(huán)境污染和能源短缺提供了一個(gè)有效途徑。顯然,獲得適用于特定工業(yè)環(huán)境的不同種類的糖苷水解酶是降低工業(yè)生產(chǎn)成本,加快木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。雖然糖苷水解酶設(shè)計(jì)工作已經(jīng)有很多成功的先例,但對(duì)它們的活性架構(gòu)和催化過(guò)程分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不深入。本文基于結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)方法,對(duì)GH5主要亞家族的纖維素酶和甘露聚糖酶進(jìn)行了序列、結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)態(tài)等方面的分析,定位了活性架構(gòu)中與底物特異性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基,并對(duì)TfCe15A活性中心殘基進(jìn)行了丙氨酸篩選及功能分析,初步闡明GH5家族酶分子不同亞位點(diǎn)關(guān)鍵殘基在酶催化中發(fā)揮的不同功能,為進(jìn)一步的酶分子設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。本文的主要內(nèi)容如下:1.通過(guò)對(duì)糖苷水解酶GH5家族中6個(gè)主要亞家族酶分子的結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析,闡明了不同亞家族酶分子間的主要異同點(diǎn)。對(duì)GH5家族主要亞家族序列、結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)態(tài)分析顯示,不同亞家族酶分子的主要差異存在于構(gòu)成活性架構(gòu)的8個(gè)loop 區(qū)域。比較不同亞家族活性中心序列譜發(fā)現(xiàn),GH5家族酶分子負(fù)亞位點(diǎn)殘基保守度最高,-1亞位點(diǎn)有3個(gè)殘基在整個(gè)GH5家族內(nèi)是完全保守的,一2亞位點(diǎn)也有一個(gè)色氨酸在GH5家族內(nèi)完全保守,這些殘基可能與催化斷鍵密切相關(guān);還有部分殘基在單個(gè)亞家族內(nèi)保守或相對(duì)保守,這些殘基可能與不同亞家族之間的功能演化相關(guān)。2.通過(guò)對(duì)GH5_2亞家族纖維素酶和GH5_8甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)分析和生化測(cè)定,發(fā)現(xiàn)了活性架構(gòu)-1和-2亞位點(diǎn)關(guān)鍵殘基在兩個(gè)亞位點(diǎn)不同的底物識(shí)別機(jī)制。由于纖維素和甘露聚糖底物-1亞位點(diǎn)糖環(huán)不同程度的扭曲,在該亞位點(diǎn)兩類底物O3空間位置存在差異,而在-2亞位點(diǎn),纖維素和甘露聚糖差異在于O2的空間位置。相應(yīng)地,結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果顯示,在-1亞位點(diǎn),兩個(gè)亞家族保守的組氨酸和天冬酰胺通過(guò)與-1O3的相互作用起到底物識(shí)別作用,而在-2亞位點(diǎn),GH5 2亞家族相對(duì)保守的谷氨酸通過(guò)與-2O2的相互作用起到底物識(shí)別作用。3.通過(guò)對(duì)TfCe15A所有活性中心氨基酸殘基的丙氨酸篩選及生化測(cè)定,揭示了活性中心殘基在酶催化過(guò)程中發(fā)揮的不同作用。對(duì)TfCel5A活性中心共22個(gè)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了丙氨酸突變及結(jié)合常數(shù)Ka和酶活測(cè)定,并分析了關(guān)鍵殘基在酶催化中發(fā)揮的功能。Ka測(cè)定結(jié)果顯示,負(fù)亞位點(diǎn)殘基在底物結(jié)合中至關(guān)重要,其中-2亞位點(diǎn)保守的色氨酸和-2/-3亞位點(diǎn)相對(duì)保守的帶電殘基對(duì)通過(guò)與底物-2/-3亞位點(diǎn)形成密集的氫鍵網(wǎng)絡(luò)在底物初始結(jié)合中發(fā)揮了重要作用。酶活測(cè)定顯示,-2到+1亞位點(diǎn)殘基在催化斷鍵中至關(guān)重要,其中與-1O2相互作用的保守組氨酸和酪氨酸通過(guò)穩(wěn)定親核試劑并維持其帶電狀態(tài)來(lái)協(xié)助催化斷鍵;與-1O3相互作用的保守組氨酸和天冬酰胺通過(guò)與底物間的相互作用協(xié)助-1亞位點(diǎn)糖環(huán)的扭曲,該過(guò)程需要loop3較大幅度的運(yùn)動(dòng);此外,-2和+1亞位點(diǎn)兩個(gè)保守色氨酸也參與底物形變過(guò)程;根據(jù)相關(guān)殘基在GH5家族中的高保守度可知,它們?cè)诖呋瘮噫I中發(fā)揮的重要作用在整個(gè)GH5家族中是一致的。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q55
【部分圖文】：

乳糖醛酸Ｉ（ＲＧＩ），其主鏈?zhǔn)怯砂肴樘侨┧岷褪罄钐峭ㄟ^(guò)ａ－１，２和ａ－１，４糖苷鍵交??替連接而成，這類果膠的側(cè)鏈主要為Ｐ－Ｕ４－半乳聚糖、ｐ－１．６－半乳聚糖和（Ｘ－１．５－??阿拉伯聚糖（圖１－１?Ｅ）。??由于果膠結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其合成需要超過(guò)６５種不同酶活性，其中包括半乳??糖醛酸轉(zhuǎn)移酶等主鏈合成酶以及甲基轉(zhuǎn)移酶、｜３－１，４－半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和ａ－１，３－木??糖基轉(zhuǎn)移酶等側(cè)鏈合成酶［２５－２７］。??％?＜?ＨＩｂＵｍ?■Ｍｒａｆｌｂｒｌｌ?ＨｒＭｔｃＨｔａｔｎＭ??ｎ．?＿齟．．????。；：??圖１－１植物細(xì)胞壁的主要多糖成分｜６，?１９｜??（Ａ）細(xì)胞壁中主要多糖相互作用的簡(jiǎn)化模型。（Ｂ）纖維素基元纖絲的３６鏈模型。這??里葡聚糖鏈的描述是基于Ｘ光衍射測(cè)定的纖維素１卩結(jié)構(gòu)。纖維素基元纖絲可能含有三??組葡聚糖鏈：Ｃ１組（紅色）是六個(gè)真正的結(jié)晶鏈；Ｃ２組（綠色）中有１２個(gè)具有微小??雜亂度的亞結(jié)晶鏈；Ｃ３組（藍(lán)色）中有１８?jìng)�(gè)具有很大雜亂度的亞結(jié)晶表面鏈。（Ｃ）??纖維素Ｉｐ結(jié)構(gòu)中的鏈內(nèi)和鏈間氫鍵網(wǎng)絡(luò)。（Ｄ）半纖維素結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖。（Ｅ）果膠結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｍａｉｎ?ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ?ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ?ｏｆ?ｐｌａｎｔ?ｃｅｌｌ?ｗａｌｌｓ??（Ａ）?Ａ?ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｍｏｄｅｌ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｍａｊｏｒ?ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｗａｌｌ．?（Ｂ）?Ａ?３６－??ｃｈａｉｎ?ｍｏｄｅｌ?ｏｆ?ｃｅｌｌｕ

ＣＨＧ）、木糖聚半乳糖醛酸（ＸＧ）和鼠李聚半乳糖醛酸ＩＩ?（ＲＧＩ１）主鏈降解主要??需要來(lái)自ＧＨ２８家族的內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶（ＥＣ３．２．Ｉ．１５）和外切聚半乳糖醛酸??酶（ＥＣ３．２．１．６７），而，鼠李聚半乳糖醛酸Ｉ?（ＲＧＩ）主鏈降解主要需要同樣來(lái)自??ＧＨ２８家族的內(nèi)切鼠李聚半乳糖醛酸酶（ＥＣ?３．２．１．１７１）、外切鼠李聚半乳糖醛酸??酶（ＥＣ?３．２．１．１７３）和ａ－鼠李糖苷酶（ＥＣ?３．２．１．４０）。此外，來(lái)自ＰＬ１家族的果膠??裂解酶和來(lái)Ｇ?ＰＬＩ、ＰＬ３和ＰＬ９采膠酸裂解酶等在果膠主鏈降解中也發(fā)揮了重要??作用（圖?１－２）?［６１－６３］。??除了主鏈降解酶外，果膠的降解還需要大量的側(cè)鏈降解酶，如來(lái)自ＧＨ５１和??ＧＨ５４家族的ａ－阿拉伯呋喃糖苷酶、來(lái)自ＧＨ４３家族的內(nèi)切阿拉伯聚糖酶、來(lái)自??ＧＨ９３家族的外切阿拉伯聚糖酶、來(lái)自ＧＨ２和ＧＨ３５家族的（３－半乳糖苷酶、來(lái)??自ＧＨ５３家族的ｐ－內(nèi)切半乳聚糖酶以及來(lái)Ａ?ＧＨ３和ＧＨ４３家族的Ｐ－木糖苷酶??等。此外，來(lái)自ＣＥ８家族的果膠甲基酯酶、來(lái)自ＣＥ１２和ＣＥ１６家族的果膠乙酰??基酯酶和來(lái)自ＣＥ１的阿魏酸酯酶也在果膠側(cè)鏈降解中發(fā)揮ｆ重要作用。??

空間結(jié)構(gòu)中連續(xù)成簇存在并在進(jìn)化中存在較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，被稱為蛋白質(zhì)功能區(qū)??（Ｓｅｃｔｏｒ）?［６４］。在酶分子中，最重要的功能區(qū)是“活性架構(gòu)（Ａｃｔｉｖｅ－ｓｉｔｅ?ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）’’，??其由與底物相互作用的氨基酸殘基構(gòu)成（圖１－３），占整個(gè)酶的２％－３°／。，在酶底??物識(shí)別、催化和產(chǎn)物釋放中發(fā)揮重要作用［６，?６５］。??在糖苷水解酶中，活性架構(gòu)殘基參與糖類底物的識(shí)別和結(jié)合、糖苷鍵的斷裂??以及寡糖和單糖產(chǎn)物的釋放，因此與酶的底物特異性和酶活力直接相關(guān)。由于活??性架構(gòu)殘基在進(jìn)化中的關(guān)聯(lián)性，同家族酶的活性架構(gòu)殘基具有一定的保守性，這??些保守和相對(duì)保守的殘基在酶功能的執(zhí)行中發(fā)揮了重要作用［６６－６８］。??ＴｉＣｅ＼５＼?ＴｉＣｄｌＢ?ＴｉＣｅＷｌＡ??聲：書．??圖１－３來(lái)自不同家族里氏木霉纖維素酶的活性架構(gòu)??從左到右分別來(lái)自ＧＨ５?（ＰＤＢ３ＱＲ３，底物來(lái)自結(jié)構(gòu)２ＣＫＲ）、ＧＨ７?（ＰＤＢ１ＥＧ１，底??物來(lái)自結(jié)構(gòu)４Ｃ４Ｃ）和ＧＨ１２家族（ＰＤＢ１Ｈ８Ｖ，底物來(lái)自結(jié)構(gòu)１Ｗ２Ｕ）。酶分子以灰??色卡通和表面模式顯示，活性架構(gòu)顯示為藍(lán)色，底物顯示為綠色。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ａｃｔｉｖｅ?ｓｉｔｅ?ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ?ｒｅｅｓｅｉ?ｃｅｌｌｕｌａｓｅ?ｆｒｏｍ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ＧＨ??ｆａｍｉｌｉｅｓ??Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｆｒｏｍ?ｌｅｆｔ?ｔｏ?ｒｉｇｈｔ?ａｒｅ?ｆｒｏｍ?ＧＨ５?（ＰＤＢ?３ＱＲ３．?ｓｕｂｓｔｒａｔｅ?ｆｒｏｍ?２ＣＫＲ）
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