發(fā)布時(shí)間：2024-07-09 05:50

　　雖然經(jīng)典遺傳操作工具在少數(shù)模式細(xì)菌中有著很好的效果,但并不適用于大多數(shù)重要病原菌在內(nèi)的其它細(xì)菌。新型基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9由于存在表達(dá)元件復(fù)雜、脫靶效率高以及細(xì)菌存在抗Cas9分子等因素,限制了該技術(shù)在很多病原菌中的應(yīng)用。因此,開發(fā)通用、簡(jiǎn)便、高效、無(wú)痕的遺傳操作工具對(duì)于病原菌致病機(jī)制和防控技術(shù)的研究具有重要的價(jià)值和意義。多殺性巴氏桿菌對(duì)豬、牛、雞、鴨等畜禽養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重,缺乏高效的遺傳操作工具極大限制了該病原菌致病機(jī)理的研究及防控產(chǎn)品的研發(fā)。為了研究禽多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)理和基因工程疫苗,我們實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用多種經(jīng)典遺傳操作系統(tǒng),如溫敏自殺系統(tǒng)、Sac B篩選系統(tǒng)、galk篩選系統(tǒng)及thy A篩選系統(tǒng)等,來(lái)構(gòu)建禽多殺性巴氏桿菌基因缺失突變株但都未成功。后來(lái)采用NgAgo/gDNA系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了禽多殺性巴氏桿菌和兔多殺性巴氏桿菌靶基因的敲除和敲入,并獲得了毒力下降的疫苗候選菌株,說(shuō)明NgAgo/gDNA系統(tǒng)為多殺性巴氏桿菌致病機(jī)制和防控產(chǎn)品的研究提供了遺傳操作工具,但該系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)菌基因組編輯的分子機(jī)制并不清楚。鑒于此,本論文主要研究原核生物Argonaute(pAgo)蛋白...

【文章頁(yè)數(shù)】：209 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖1Tn5轉(zhuǎn)座機(jī)制

原核生物Argonaute(pAgo)蛋白介導(dǎo)細(xì)菌基因組編輯及其機(jī)制研究3BarbaraMclintock在玉米中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子以來(lái)(GierlandSaedler1992)，轉(zhuǎn)座子作為重要的插入突變劑或分子標(biāo)簽廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌和其它微生物功能基因組研究中，成為重要病原菌等微生物....

圖2溶血巴氏桿菌aroA突變株的構(gòu)建

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆博士研究生學(xué)位論文10春等人采用同樣方法將Kan抗性基因表達(dá)盒與aroA基因替換，成功獲得了毒力減弱的兔多殺性巴氏桿菌aroA突變株(郭冬春等2012)。Xiao等人利用該技術(shù)將禽多殺性巴氏桿菌phoP基因替換為kan抗性基因而快速獲得突變株(Xiaoeta....

圖3利用SacB篩選系統(tǒng)構(gòu)建幽門螺桿菌vacA基因缺失突變株的策略

導(dǎo)入幽門螺桿菌株中；其次，利用Kan抗性篩選出kan-SacB盒與vacA基因發(fā)生同源交換的菌株，即kan-SacB盒替代vacA基因的菌株；最后電轉(zhuǎn)入有vacA左右同源臂的空載質(zhì)粒，在有5%蔗糖以及無(wú)Kan的條件下迫使kan-SacB盒與....

圖4galK篩選系統(tǒng)的方案

原核生物Argonaute(pAgo)蛋白介導(dǎo)細(xì)菌基因組編輯及其機(jī)制研究13大片段人工染色體BAC提供了遺傳操作工具，但是該系統(tǒng)必須要把galK插入到細(xì)菌染色體中，才能進(jìn)行下一步的篩選過(guò)程，導(dǎo)致該系統(tǒng)使用時(shí)較為復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。圖4galK篩選系統(tǒng)的方案。Fig.4Theschem....

本文編號(hào)：4004494