發(fā)布時間：2020-11-07 14:44

　　 龍眼(Dimocarpus longan Lour.)是熱帶亞熱帶重要果樹,具有很高的營養(yǎng)價值。龍眼易受超過20種采前和采后病害的影響,隨著全球性的對環(huán)境及食品安全的日益重視,培育減少化學農藥依賴的新型品種是農作物育種的重要方向。但龍眼育種周期長,抗性育種進展緩慢,對龍眼抗性機制產生的分子機理所知甚少。此前,我們進行了龍眼胚性培養(yǎng)物的轉錄組高通量測序,從中發(fā)現(xiàn)大量植物-病原物互作相關基因的表達,其數(shù)量占所有Unigene的8.15%,這為快速獲取龍眼抗性相關基因信息奠定了基礎。本文擬在此基礎上,利用同源克隆結合生物信息學的方法挖掘鑒定龍眼轉錄組中的NBS-LRR抗性基因、抗性相關激素信號基因以及具有廣譜抗性特性的鐵氧還蛋白家族基因,并通過進一步的生物信息學、qPCR定量表達和轉基因異位表達分析,進行基因的功能驗證,為龍眼及其他物種的抗性育種提供科學依據(jù)。1龍眼抗性基因的同源克隆NBS-LRR基因是抗性基因(Resistance gene, R gene)中的重要類型,通過其保守功能域進行同源克隆可以迅速獲得不同物種的R基因信息。通過R基因NBS保守功能域基序P-loop、Kinase-2和GLPL (AL)設計簡并引物,回收相應的條帶測序,在55個陽性克隆子中,共得到46條序列與已知NBS序列具有同源性,且彼此間沒有重復的序列,將46條序列分別命名為NBS(X), 并登錄GenBank,登錄號分別為JQ900202-JQ900227、JX007920-JX007923、JN398315-JN398318、JN398320-JN398329。將所獲得序列的推導氨基酸序列進行多重比對,可見明顯的P-loop、RNBS-A、Kinase-2、 RNBS-B 和 GLPL (AL)保守基因,其中,4條序列Kinase-2基序符合TIR-NBS-LRR(TN L)類型R基因特征,42條序列符合CC-NBS-LRR(CNL)類型R基因特征。進化樹分析顯示,46條序列可分為TNL及non-TNL兩大類群,其中,non-TNL雙可進一步分為4個亞類群�；�序分析顯示,non-TNLl及non-TNL2類群成員之員較為一致,但沒有聚類到已知類型的R基因,可能為龍眼特有的類群。本試驗發(fā)現(xiàn),盡管龍眼胚性培養(yǎng)物存在于無菌條件下同,但存在類型豐富的R基因表達,利用簡并引物是快速了解在龍眼培養(yǎng)性培養(yǎng)物中所表達R基因類型的快速而有效的方法一。2 龍眼胚性培養(yǎng)物轉錄組數(shù)據(jù)庫R基因的挖掘盡管利用同源克隆法可對基序較為保守的R基因進行有效的分離,但難以對全基因組或轉錄組范圍內表達的R基因進行較為全面的篩選。本試驗通過關鍵詞結合批量BLAST在龍眼胚性培養(yǎng)物轉錄組數(shù)據(jù)庫挖掘R基因,在全部68925條Unigene中在得到1406條不重復的序列與抗性相關,其中含有NB-ARC結構域的221條,含有TIR結構的40條。通過對相對具有完整NBS結構的73條序列進行進化樹分析,發(fā)現(xiàn)類群劃分與上述同源克隆所獲得序列進化樹分析結果相似。所有R基因中TNL類群15條,占24.7%,而non-TNL類群的R基因58條,占75.3%。non-TNL1、non-TNL2亞類群無論在序列及基序方面均與現(xiàn)有其他物種R基因呈現(xiàn)較大差異。通過miRNA基因的靶向分析發(fā)現(xiàn),miR482較傾向于靶向較為保守的non-TNL3類群,而miR5018均靶向龍眼中特有的non-TNL1亞類群,而在其他物種中,還未發(fā)現(xiàn)miR5018與R基因的靶向關系。利用龍眼胚性培養(yǎng)物轉錄組進行基因挖掘可以迅速鑒定大量R基因,在龍眼胚性培養(yǎng)物轉錄組范圍內,龍眼R基因主要由non-TNL類型構成。3龍眼抗性基因的全長克隆及病原物侵染下的表達分析為驗證所獲得的R基因兩端序列的類型,以及進一步鑒定R基因的生理功能,本試驗通過RACE克隆技術共獲得13條龍眼R基因序列全長,GenBank登錄號為JQ900226,KP266525-KP266536。通過與其他物種R基因進行比對,發(fā)現(xiàn)龍眼R基因與甜橙R基因最為相似,一致性在66-79%之間。生物信息學分析發(fā)現(xiàn),所獲得R基因均沒有明顯的信號肽,但可能定位于不同的細胞器。通過對獲得全長及被niRNA所靶向的R基因進行表達分析顯示,R基因在葉片中的表達量顯著高于在龍眼胚性愈傷組織中的表達量,并且多數(shù)R基因在病原物侵染后呈現(xiàn)表達量的提高,其中,被niRNA預測靶向的R基因在病原物侵染后表現(xiàn)更為明顯的表達變化；在不同信號激素下,不同成員呈現(xiàn)不同的表達規(guī)律。結果表明,龍眼R基因家族龐大,進化程度高,在抗性過程中存在復雜的表達調控網絡。本試驗通過龍眼R基因特別是不同亞類群R基因全長的克隆及表達分析,初步了解龍眼R基因的組成類型,并為進一步的R基因功能轉化鑒定提供了可能。4龍眼抗性相關激素信號標記基因克隆與表達分析在龍眼中,病原物與植株的互作的分子機制還所知甚少,影響了對龍眼R基因的功能鑒定的進行�？剐韵嚓P激素信號標記基因的克隆與鑒定是研究植物與病原物互作的良好工具。本試驗利用擬南芥水楊酸信號標記途徑基因PR1,(AT2G14610)、PR2(AT3G57260)、茉莉酸／乙’烯信號途徑標記基因ERF1(AT3G23240)、茉莉酸信號途徑標記基因VSP2(AT5G24770)、乙烯信號途徑標記基因PDE1.2(AT5G44420)于龍眼胚性培養(yǎng)物轉錄組挖掘同源序列,并進行全長克隆,共獲得9條全長及1條5'序列的水楊酸、茉莉酸及乙烯信號途徑標記基因,GenBank登錄號為KP266536-KP66545。經BLAST及保守功能域分析,所獲得序列均與擬南芥相應標記基因具有一致性。通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn),除VSP2-1,所有序列可響應病原物的侵染上調表達。在不同激素處理下,發(fā)現(xiàn)龍眼PRl-1、PR2-1、ERF1-2、 VSP2-2、PDF1.2-1與相應的同源擬南芥標記基因較為類似,能特異響應SA、ET及JA信號處理。結果表明,利用同源克隆法可以在龍眼得到特異性響應不同激素的標記基因,是快速獲取此類基因的方法一,此類基因的克隆,將對將來R基因功能的鑒定及龍眼與病原物互作的分子機制提供重要的分析工具。5龍眼廣譜抗性基因鐵氧還蛋白的克隆、亞細胞定位與表達分析R基因通過直接或間接識別病原效應因子,對病原物的識別具有�；�性,而鐵氧還蛋白作為光合電子傳遞鏈的關鍵蛋白,在多種植物上被證實具有廣譜的對抗生物及非生物脅迫的能力。利用數(shù)據(jù)庫基因挖掘并結合RACE技術,本試驗獲得5條Fd全長基因序列,GenBank登錄號分別為JF733784、JF957855、JF957856、JF957857及JF957858。系統(tǒng)進化樹分析顯示,所獲得的鐵氧還蛋白分別為葉綠體類非光合類型的Fd3、FdC1、FdC2以及線粒體類的MFDX基因。將Fd3、FdC1導入煙草進行亞細胞定位分析,發(fā)現(xiàn)二者均定位于葉綠體,與所預測位置相符。所有類型的鐵氧還蛋白在體胚發(fā)生過程有類似的表達模式,并在心形胚時期大量表達。6異位表達龍眼鐵氧還蛋白文心蘭的抗病性與基因表達變化分析利用此前已建立的高效文心蘭農桿菌轉化體系,將龍眼Fd3、FdCl基因導入文心蘭原球莖,通過一系列篩選培養(yǎng)獲得再生植株,發(fā)現(xiàn)Fd3基因可以提高文心蘭對抗軟腐病的能力及移栽成活率。印度梨型孢菌是研究植物與菌共生互作的模式菌株,可為共生植株帶來廣譜抗性。印度梨型孢菌是研究菌與植物共生的模式菌株,能為寄主植物帶來廣譜抗性。通過miRNA高通量測序及qPCR基因表達分析顯示,在共生過程中,miRNA通過調控生長素相關基因及發(fā)育相關基因參與共生關系的建立。異位表達龍眼Fd3植株在接種印度梨型孢菌后顯著改變了文心蘭miR166、miR168、miR169與miR397及其靶基因PHV、AGO、NTF與LAC的表達水平,而轉化龍眼FdCl植株呈現(xiàn)相反的表達趨勢。綜上所述,本試驗通過同源克隆法與轉錄組挖掘技術相結合,分離了大量的龍眼R基因片段并獲得13條的全長序列,進而對R基因在病原物侵染下及不同激素信號調控下的表達模式分析,發(fā)現(xiàn)植株可能通過整體調控R基因來響應病原物的侵染以獲得SAR,其中miRNA所預測靶向的R基因在病原物侵染后呈現(xiàn)更為顯著的上調表達；為進一步鑒定R基因的功能,從龍眼轉錄組中挖掘與擬南芥抗性相關激素信號標記基因具有一致性的序列并獲得9條全長序列及1條5'末端序列,其中PR1-1、PR2-1、ERF1-2、VSP2-2、PDF1.2-1能特異性響應相關激素信號；進行了廣譜抗性基因Fd基因在龍眼胚性培養(yǎng)物轉錄組的基因挖掘與克隆,共獲得5條Fd全長基因序列,分別為葉綠體類非光合類型的Fd3、FdC1、FdC2以及線粒體類的MFDX基因,利用農桿菌介導法將龍眼Fd3、FdCl基因導入文心蘭原球莖,通過一系列篩選培養(yǎng)獲得再生植株,發(fā)現(xiàn)Fd3基因可以提高文心蘭對抗軟腐病的能力及移栽成活率,異位表達Fd3植株在接種印度梨型孢菌后顯著改變了文心蘭miRNA及其靶基因PHV、NTF、AGO及LAC的表達水平。本試驗的研究結果將為進一步挖掘鑒定有效的龍眼抗性相關基因提供幫助,并為龍眼及其他物種的分子抗性育種提供科學依據(jù)。
【學位單位】：福建農林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S667.2;Q943.2
【文章目錄】：
縮寫詞
摘要
Abstract
引言
    1 植物體胚發(fā)生抗性相關基因克隆研究進展
    2 植物抗病防御機制研究進展
        2.1 R基因的研究進展
        2.2 植物激素信號途徑抗性相關基因研究進展
        2.3 廣譜抗性基因鐵氧還蛋白基因在植物抗性育種中的研究進展
    3 龍眼抗性基因工程研究進展
    4 本研究的意義和主要內容
第一章 龍眼抗性基因的同源克隆
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結果與分析
        2.1 龍眼RGA序列擴增
        2.2 龍眼RGA氨基酸序列多重序列比對
        2.3 龍眼RGA序列進化樹分析
        2.4 龍眼RGA氨基酸序列基序分析
        2.5 龍眼miRNA靶向的RGA序列預測
    3 討論
        3.1 利用龍眼EC cDNA是進行NBS類R基因克隆的良好材料
        3.2 non-TNL類型為簡并引物克隆RGA序列的主要類型
        3.3 龍眼RGA中存在可變剪接的序列
第二章 龍眼胚性愈傷轉錄組抗性基因的挖掘與鑒定
    1 材料與方法
        1.1 基因挖掘
        1.2 序列分析
    2 結果
        2.1 龍眼轉錄組R基因的挖掘
        2.2 龍眼轉錄組R基因的進化樹分析
        2.3 miRNA靶向龍眼NBS序列預測
    3 討論
        3.1 龍眼EC存在表達類型豐富的R基因
        3.2 non-TNL類型R基因為龍眼R基因的主要類型
        3.3 龍眼non-TNL1及non-TNL2亞類群R基因較不保守
第三章 龍眼R基因全長的克隆及定量表達分析
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結果
        2.1 龍眼R基因全長克隆
        2.2 龍眼R基因生物信息學分析
        2.3 龍眼R基因的熒光定量表達分析
    3 討論
        3.1 龍眼R基因與其他物種R基因呈現(xiàn)較大的差異
        3.2 龍眼CNL類型R基因CC結構的生理功能
        3.3 龍眼R基因可能通過整體響應病原物的侵染使植株產生SAR
        3.4 靶向龍眼R基因的miRNA可能在植物與病原物的互作中產生重要作用
第四章 龍眼抗性相關激素信號途徑標記基因的克隆與表達分析
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結果
        2.1 龍眼不同激素信號途徑標記基因挖掘
        2.2 龍眼不同激素信號途徑標記基因序列分析
        2.3 龍眼不同激素信號途徑標記基因熒光定量表達分析
    3 討論
        3.1 龍眼胚性培養(yǎng)物中不同激素信號途徑標記基因
        3.2 龍眼激素信號途徑標記基因家族不同成員在病原物及激素處理下呈現(xiàn)不同的表達規(guī)律
第五章 龍眼鐵氧還蛋白家族基因的克隆及表達分析
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結果與分析
        2.1 龍眼轉錄中Fd及Fld家族基因的挖掘
        2.2 龍眼Fd及tyw1基因全長克隆
        2.3 龍眼Fd及tyw1基因序列分析
        2.4 龍眼Fd基因亞細胞定位
        2.5 龍眼不同類型Fd基因在EC不同階段表達分析
    3 討論
        3.1 龍眼EC中表達的Fd基因類型
        3.2 龍眼Fd基因在龍眼體細胞胚胎發(fā)生的作用
        3.3 龍眼tyw1基因與[Fe-S]簇結合在龍眼胚胎發(fā)生過程中參與RNA轉錄后修飾
第六章 龍眼鐵氧還蛋白基因在文心蘭異位表達
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結果
        2.1 文心蘭PLB抗性培養(yǎng)
        2.2 不同農桿菌菌株對文心蘭PLB的轉化效率影響
        2.3 轉化文心蘭植物的陽性檢測
        2.4 轉化文心蘭植物的抗軟腐病檢測
    3 討論
        3.1 文心蘭基因轉化的篩選標記基因
        3.2 不同品種農桿菌對文心蘭轉化效率影響
        3.3 龍眼Fd3較FdC1抗軟腐病效應明顯
第七章 異位表達龍眼鐵氧還蛋白在文心蘭與印度梨形孢共生中的MIRNA表達變化
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結果
        2.1 印度梨形孢促文心蘭生長與生根效應
        2.2 文心蘭miRNA及其靶基因的注釋
        2.3 轉化龍眼Fd基因文心蘭miRNA及其靶基因的熒光定量分析
    3 討論
        3.1 miR156與miR397在轉化龍眼Fd基因的植株中呈現(xiàn)不同的表達規(guī)律
        3.2 龍眼Fd3可能促進梨形孢在文心蘭的共生進程的建立
主要結論及創(chuàng)新點
參考文獻
附錄一 46條同源克隆RGA核酸序列
附錄二 龍眼R基因全長序列
附錄三 13條NBS-LRR類R基因全長蛋白序列多重比對分析
附錄四 龍眼抗性相關激素信號途徑標記基因核酸序列
附錄五 龍眼鐵氧還蛋白家族基因核酸序列
在讀博士期間發(fā)表論文情況及參加學術會議情況

【參考文獻】

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本文編號：2874088