發(fā)布時間：2020-11-20 13:34

　　 著床前胚胎發(fā)育是一個受到精密調(diào)控的發(fā)育過程。研究著床前胚胎發(fā)育機制對于生殖生物學(xué)及再生醫(yī)學(xué)都有深遠意義,因此著床前胚胎發(fā)育一直倍受矚目。在著床前胚胎發(fā)育過程中會發(fā)生一系列特異事件,如合子基因激活(zygote genome activation,ZGA)。長非編碼RNA(long non-coding RNAs,lnc RNAs)參與調(diào)控已經(jīng)成為新的生物學(xué)研究領(lǐng)域。隨著測序技術(shù)的進步,大量lnc RNA在早期胚胎中被發(fā)現(xiàn),但是,目前還沒有研究能夠回答有沒有一些lnc RNA會參與到著床前胚胎發(fā)育調(diào)控過程中,如果有,這些lnc RNA以怎樣的機制參與調(diào)控。內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(Endogenous retroviruses,ERVs)是進化上內(nèi)化于高等有顎脊椎動物基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列元件。內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序列廣泛分布,占人類基因組的8%,占小鼠基因組的10%。內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序列曾一度被認為是垃圾DNA,但越來越多的證據(jù)表明,內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序列參與了多方面生物學(xué)調(diào)控。病毒序列編碼的蛋白質(zhì)可參與宿主細胞功能。有些內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒尚保持轉(zhuǎn)座能力,對于生殖細胞內(nèi)基因重組等進化相關(guān)事件起到關(guān)鍵作用。我們早就知道小鼠ERV在著床前胚胎中轉(zhuǎn)錄,但具體發(fā)揮什么功能尚不清楚。是否存在ERV相關(guān)的lnc RNA參與著床前胚胎發(fā)育調(diào)控值得研究。我們針對ERVs的精心設(shè)計了半隨機引物,通過半隨機擴增,從小鼠早期胚胎各時期篩選m ERV相關(guān)未知轉(zhuǎn)錄本,經(jīng)過分子克隆技術(shù)(鏈特異性PCR及RACE等)獲得至少一個轉(zhuǎn)錄本全長,分析其是否為lnc RNA。對明確是lnc RNA的未知轉(zhuǎn)錄本進行亞細胞定位分析、表達模式分析以及功能研究。具體結(jié)果如下:通過PCR及測序結(jié)果的UCSC比對分析,我們鑒定出了36個新轉(zhuǎn)錄本。大部分新轉(zhuǎn)錄本(28/36)是ERV相關(guān)的,與預(yù)期相符。其中23個是GLN相關(guān)的,5個是Mu ERVL相關(guān)的;通過鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄PCR以及RACE技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)lnc-GET是GLN,MERVL及MERVK相關(guān)的、可剪切的、有多聚腺苷酸尾的、含兩種剪切突變體的RNA;Dyei是由GLN的LTR轉(zhuǎn)錄的、長665 nt的、GLN相關(guān)的、含3個外顯子的RNA。亞細胞定位分析表明lnc-GET和Dyei定位于核,且主要是染色質(zhì)定位的,因此lnc-GET和Dyei是非編碼的。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及mi RNA反義Northern印記實驗排除了lnc-GET和Dyei是mi RNA前體的可能性。Taq Man定量PCR實驗及RNA-FISH實驗表明,lnc-GET是2-至4-細胞胚胎特異表達的,Dyei是4-細胞胚胎特異表達的;干擾lnc-GET導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯于2-細胞時期,而干擾Dyei不影響著床前胚胎發(fā)育。干擾lnc-GET的胚胎在培養(yǎng)液中能維持2-細胞狀態(tài)至少4天而不凋亡。干擾lnc-GET阻滯的胚胎呈Brd U強陽性、CAF1陰性,表明阻滯于G2時期,呈H3第10位精氨酸磷酸化(H3S10ph)染色陽性,表明阻滯于G2晚期。γH2A.X免疫熒光染色呈陰性,表明阻滯不是由于DNA損傷導(dǎo)致的。阻滯胚胎內(nèi),G2/M轉(zhuǎn)換相關(guān)關(guān)鍵細胞周期蛋白依賴的蛋白酶CDK1以及母源蛋白OCT4和CDX2沒有顯著變化;主要合子基因激活(major ZGA)起始不受影響。我們還發(fā)現(xiàn)臂間衛(wèi)星序列的正義鏈及反義鏈轉(zhuǎn)錄本表達水平?jīng)]有變化,DNA-FISH結(jié)果顯示臂間環(huán)已經(jīng)變成了染色中心;通過低起始量RNA-seq我們比較了注射對照鎖核酸(LNA)的對照晚期2-細胞胚胎(2225枚)與干擾lnc-GET的阻滯2-細胞胚胎(2042枚)在major ZGA時期的基因表達情況�？傮w上講,在干擾lnc-GET的阻滯2-細胞胚胎中有723個基因上調(diào),521個基因下調(diào)(FDR≤0.0001,RPKM≥1,2倍以上),多達11060個基因發(fā)生了異常剪切,表明干擾lnc-GET造成了major ZGA嚴(yán)重異常。KEGG通路分析表明干擾lnc-GET主要影響了MAPK信號通路,表現(xiàn)在ERK1/2-MAPK及LNK/p38-MAPK通路的核心因子表達量顯著下降。異常剪切基因的GO-BP分析結(jié)果表明發(fā)生異常剪切的基因主要聚類于細胞周期相關(guān)基因(主要是M周期相關(guān)的)。表明干擾lnc-GET造成的阻滯可能是影響了細胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及可變剪切導(dǎo)致的;我們通過pulldown-質(zhì)譜來檢測lnc-GET結(jié)合的蛋白,鑒定出了hn RNP U、FUBP1、DAZAP1及ILF2。這4個蛋白定位于晚期2-細胞及早期4-細胞核內(nèi),說明是與lnc-GET共定位的。這4個蛋白都是剪切復(fù)合體組分,3個是轉(zhuǎn)錄因子,表明pulldown-質(zhì)譜結(jié)果與RNA-seq結(jié)果相符:lnc-GET可能參與了轉(zhuǎn)錄及剪切調(diào)控;無論通過Wilcoxon rank sum檢驗結(jié)合Benjamin多重檢驗,還是Wilcoxon rank single檢驗(p2.2×10-16)均發(fā)現(xiàn)DEGs傾向于富集在其相關(guān)的GLN,Mu ERVL及ERVK的LTR(GLK-LTRs)附近。因此lnc-GET可能是通過介導(dǎo)GLK-LTR的順式調(diào)控元件的活性來實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q132
【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 長非編碼RNA研究現(xiàn)狀
        1.1.1 lnc RNA與X染色體失活
        1.1.2 lnc RNA與基因印記
        1.1.3 lnc RNA與Hox基因簇調(diào)控
        1.1.4 lnc RNA與卵裂期染色中心形成
        1.1.5 lnc RNA與神經(jīng)命運特化
        1.1.6 lnc RNA與ES多能性維持及分化
        1.1.7 lnc RNA與疾病
        1.1.8 lnc RNA與凋亡及細胞周期調(diào)控
        1.1.9 lnc RNA與免疫
        1.1.10 lnc RNA與線粒體調(diào)節(jié)
    1.2 lnc RNA調(diào)控的機制
        1.2.1 lnc RNA參與轉(zhuǎn)錄前調(diào)控
        1.2.2 lnc RNA參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        1.2.3 lnc RNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控
    1.3 內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒
        1.3.1 內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒元件作為啟動子或增強子或poly A
        1.3.2 內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒元件表達病毒蛋白參與細胞功能
        1.3.3 內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)轉(zhuǎn)錄本
    1.4 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.1.3 主要試劑及試劑盒
        2.1.4 主要抗體
        2.1.5 常用試劑及配制
        2.1.6 主要的生物分析軟件及網(wǎng)站
    2.2 實驗方法
        2.2.1 半隨機擴增篩選ERV相關(guān)lnc RNA
        2.2.2 鏈特異性PCR
        2.2.3 亞細胞定位分析
        2.2.4 表達模式分析
        2.2.5 5'RACE
        2.2.6 3'RACE
        2.2.7 RNA-FISH
        2.2.8 DNA-FISH
        2.2.9 胚胎Brd U免疫熒光檢測
        2.2.10 胚胎EU檢測
        2.2.11 mi RNA reverse Northern Blot
        2.2.12 RNA pulldown
        2.2.14 RNA干擾
        2.2.15 低起始量RNA-seq
        2.2.16 選擇性剪切驗證
3 結(jié)果與分析
    3.1 篩選出36個未知轉(zhuǎn)錄本
        3.1.1 半隨機擴增
        3.1.2 UCSC比對篩選位置轉(zhuǎn)錄本
        3.1.3 部分新轉(zhuǎn)錄本在著床前胚胎表達模式分析
    3.2 lnc-GET及Dyei是lnc RNA
        3.2.1 lnc-GET及Dyei的全長分析
        3.2.2 lnc-GET及Dyei的蛋白編碼能力分析
        3.2.3 lnc-GET及Dyei不是pri-mi RNA
    3.3 lnc-GET及Dyei的表達模式分析
    3.4 干擾Dyei不影響小鼠著床前胚胎發(fā)育
    3.5 干擾lnc-GET導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育阻滯于 2-細胞晚期G2期
    3.6 lnc-GET干擾阻滯 2-細胞的特征
    3.7 lnc-GET與ILF2、hn RNP U、DAZAP1、FUBP1互作
    3.8 lnc-GET可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄及RNA剪切實現(xiàn)其功能
4 討論
    4.1 lnc RNA的半隨機擴增篩選
    4.2 ERV在著床前胚胎內(nèi)的功能
    4.3 lnc-GET的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制類似增強字樣lnc RNA
    4.4 lnc-GET與CARM1的互作
    4.5 lnc-GET與選擇性剪切
    4.6 lnc-GET的過表達
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉靜;A Novel Vector for Abundant Expression of Antisense RNA, Triplex forming RNA and Ribozyme in vivo[J];High Technology Letters;2000年04期

2 魯慧英;Detection of hepatitis C virus RNA sequences in cholangiocarcinomas in Chinese and American patients[J];Chinese Medical Journal;2000年12期

3 梁小兵 ,萬國江 ,黃榮貴;Distribution and Variation of Ribonucleic Acid (RNA) and Protein and Its Hydrolysis Products in Lake Sediments[J];Chinese Journal of Geochemistry;2002年02期

4 Verheyden B ,徐其武;口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗核殼和RNA的穩(wěn)定性[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;2002年01期

5 CMBE譯文組;探索小RNA的功能[J];現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志;2004年03期

6 沈維干;RNA interference and its current application in mammals[J];Chinese Medical Journal;2004年07期

7 孫娣;汪洋;張麗娟;閆玉清;;一種簡捷提取植物總RNA的方法[J];黑龍江醫(yī)藥;2005年06期

8 南海波;;小麥總RNA的提取[J];渤海大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2006年01期

9 王冬來;;RNA干擾的成功與困惑[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2008年06期

10 楊靜;;試驗性的小RNA藥物可能引發(fā)失明[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2009年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王趙瑋;昆蟲RNA病毒復(fù)制及昆蟲抗病毒天然免疫機制研究[D];武漢大學(xué);2014年

2 包純;一類新非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)以及產(chǎn)生和功能的初探[D];華中師范大學(xué);2015年

3 李語麗;基于MeRIP-seq的水稻RNA m6A甲基化修飾的研究[D];中國科學(xué)院北京基因組研究所;2015年

4 熊瑜琳;miR-122靶位基因STAT3調(diào)控長鏈非編碼 RNA Lethe促進HCV復(fù)制的機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 范春節(jié);高通量測序鑒定毛竹小RNA及其功能分析[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2012年

6 王加強;小鼠著床前胚胎特異ERV相關(guān)長非編碼RNA的定向篩選及功能研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 祝宇紅;離子條件下RNA折疊穩(wěn)定性的理論研究[D];浙江大學(xué);2014年

8 劉立江;核盤菌新型RNA病毒研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 劉雪梅;隨機RNA文庫技術(shù)的建立及其應(yīng)用[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

10 付漢江;非編碼RNA克隆分析及其功能初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 陸聰兒;條紋斑竹鯊再生肝臟中差異RNA的研究[D];浙江理工大學(xué);2015年

2 張曉輝;小鼠幾種長鏈非編碼RNA基因功能的初步研究[D];昆明理工大學(xué);2015年

3 全弘揚;長鏈非編碼RNA在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的相關(guān)作用及機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

4 胡亮;DDX19A識別PRRSV基因組RNA并激活NLRP3炎癥小體[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

5 張帥兵;應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對旋毛蟲Nudix水解酶基因功能的研究[D];鄭州大學(xué);2015年

6 鄭芳芳;肺癌RNA-Seq數(shù)據(jù)中RNA編輯事件的識別算法和系統(tǒng)分析[D];蘇州大學(xué);2015年

7 陳瑞東;長鏈非編碼RNA MEG3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的實驗研究[D];蘇州大學(xué);2015年

8 劉駿武;線蟲和水稻中環(huán)狀RNA的預(yù)測及分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 李猷;利用RNA干擾技術(shù)提高番茄抗TMV侵染能力的研究[D];牡丹江師范學(xué)院;2015年

10 吳術(shù)盛;SVCV感染EPC細胞microRNA表達譜的初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號：2891490