發(fā)布時(shí)間：2021-01-09 20:13

　　抑癌因子p53在DNA損傷下被激活,抑制細(xì)胞周期或促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而保證遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。但p53抑制DNA雙鏈斷裂修復(fù),似乎與其抑癌的特性相矛盾。p53缺陷容易導(dǎo)致腫瘤發(fā)生,且p53缺陷的癌細(xì)胞對(duì)放療化療不敏感。大量證據(jù)顯示p53可被各種脅迫激活并作出不同反應(yīng),甚至在同種信號(hào)下根據(jù)不同強(qiáng)度的刺激產(chǎn)生截然相反的作用,然而其中的分子機(jī)制仍有待研究。近年來(lái)已證明p53家族中存在著多種異構(gòu)體p53,它們可以協(xié)同或拮抗p53調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路,但對(duì)其功能和生物學(xué)意義的研究才剛剛開(kāi)始。此外,p53可被高溫激活,但它究竟起著怎樣的作用還未曾報(bào)導(dǎo)。本論文從以下幾個(gè)方面來(lái)探討這些科學(xué)問(wèn)題。1、我們發(fā)現(xiàn)△133p53/△113p53僅能被γ射線照射誘導(dǎo)表達(dá),而不能被高溫和UV照射誘導(dǎo)表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)△133p53/△113p53能從轉(zhuǎn)錄水平上提高DNA雙鏈斷裂修復(fù)的關(guān)鍵基因表達(dá),從而促進(jìn)HR、SSA、NHEJ三種不同修復(fù)途徑,它不僅能提高生物體在DNA雙鏈斷裂損傷下生存能力,而且維持了遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。2、在誘導(dǎo)細(xì)胞重編程產(chǎn)生IPS的過(guò)程中,基因組DNA會(huì)因劇烈的修飾和空間結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生損傷。我們發(fā)現(xiàn)△... 

【文章來(lái)源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：212 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 研究背景和基礎(chǔ)理論依據(jù)
    1.1 p53家族
    1.2 p53異構(gòu)體
    1.3 DNA損傷與修復(fù)信號(hào)通路
    1.4 p53家族與IPS
    1.5 p53家族與ROS調(diào)控
    1.6 分子伴侶介導(dǎo)自噬（CMA）
    1.7 斑馬魚(yú)模式生物簡(jiǎn)介
2 研究材料與方法總述
    2.1 人類細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)體系及相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系的常規(guī)培養(yǎng)
        2.1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
    2.2 人類干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體系、IPS及相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)用干細(xì)胞的正常培養(yǎng)
        2.2.2 慢病毒的準(zhǔn)備
        2.2.3 細(xì)胞重編程
    2.3 斑馬魚(yú)體系及相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作
        2.3.1 實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)的品系及飼養(yǎng)
        2.3.2 斑馬魚(yú)受精卵的獲取
        2.3.3 受精卵顯微注射
    2.4 小鼠體系及相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作
        2.4.1 實(shí)驗(yàn)小鼠品系及飼養(yǎng)
        2.4.2 腫瘤移植
        2.4.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中遵循的倫理規(guī)范
    2.5 分子克隆及相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法
        2.5.1 DNA片段及相關(guān)操作
        2.5.2 感受態(tài)細(xì)胞及相關(guān)操作
    2.6 DNA相關(guān)實(shí)驗(yàn)總述
        2.6.1 基因組總DNA的提取
        2.6.2 PI染色測(cè)定細(xì)胞周期及凋亡
        2.6.3 Annexin V/7-AAD雙熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡與壞死
        2.6.4 Tune1方法檢測(cè)斑馬魚(yú)細(xì)胞凋亡
        2.6.5 Comet試驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷
    2.7 RNA相關(guān)實(shí)驗(yàn)總述
        2.7.1 RNA的提取
        2.7.2 逆轉(zhuǎn)錄及qPCR
        2.7.3 半定量PCR
        2.7.4 體外轉(zhuǎn)錄mRNA
        2.7.5 Northern-blot
    2.8 蛋白相關(guān)實(shí)驗(yàn)總述
        2.8.1 蛋白的提取
        2.8.2 Western-blot
        2.8.3 蛋白質(zhì)降解檢測(cè)
        2.8.4 免疫熒光
        2.8.5 蛋白免疫共沉淀
        2.8.6 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）
        2.8.7 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）
    2.9 細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)總述
        2.9.1 流式細(xì)胞分析（FACS）
        2.9.2 細(xì)胞集落生成實(shí)驗(yàn)（CCA）
        2.9.3 細(xì)胞活性測(cè)定（MTT）
        2.9.4 細(xì)胞衰老檢測(cè)
        2.9.5 活性氧檢測(cè)（ROS assay）
        2.9.6 GFP-LC3聚集實(shí)驗(yàn)（GFP-LC3 aggregation）
    2.10 實(shí)驗(yàn)中所用試劑總述
        2.10.1 常規(guī)試劑配方列表
        2.10.2 實(shí)驗(yàn)中所用抗體列表
        2.10.3 實(shí)驗(yàn)中所用Morpholino、siRNA列表
        2.10.4 實(shí)驗(yàn)中所用qPCR引物列表
        2.10.5 實(shí)驗(yàn)中所用探針合成用引物列表
        2.10.6 實(shí)驗(yàn)中所用克隆用引物列表
3 可視化DNA雙鏈斷裂修復(fù)檢測(cè)系統(tǒng)
    3.1 HR、SSA、NHEJ質(zhì)粒的構(gòu)建
    3.2 基于qPCR方法的定量檢測(cè)HR、SSA、NHEJ強(qiáng)度系統(tǒng)的構(gòu)建與檢驗(yàn)
    3.3 利用可視化檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)斑馬魚(yú)中DNA雙鏈斷裂修復(fù)的強(qiáng)度
    3.4 可視化DNA雙鏈斷裂修復(fù)檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用
4 △133p53促進(jìn)DNA雙鏈斷裂修復(fù)
    4.1 γ射線輻射能誘導(dǎo)△113p53/△133p53大量表達(dá)
    4.2 在斑馬魚(yú)中△113p53能促進(jìn)DNA雙鏈斷裂修復(fù),降低DNA損傷積累
    4.3 在人類細(xì)胞系中△133p53能促進(jìn)DNA雙鏈斷裂修復(fù),降低DNA損傷積累
    4.4 △113p53在DNA雙鏈損傷嚴(yán)重時(shí)保護(hù)斑馬魚(yú),抑制衰老和死亡
    4.5 △133p53在DNA雙鏈損傷嚴(yán)重時(shí)保護(hù)人類細(xì)胞,抑制衰老和死亡
    4.6 △113p53/△133p53促進(jìn)DNA雙鏈斷裂修復(fù)關(guān)鍵基因的表達(dá)
    4.7 △113p53/△133p53直接調(diào)控DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄
    4.8 在DNA雙鏈斷裂下p53信號(hào)途徑調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)模型
    4.9 結(jié)果討論
5 △133p53提高IPSC誘導(dǎo)效率并維持基因組穩(wěn)定性
    5.1 在細(xì)胞重編程過(guò)程中△133p53能被誘導(dǎo)產(chǎn)生
    5.2 △133p53能大幅提高IPS重編程效率
    5.3 △133p53在重編程過(guò)程中拮抗p53促進(jìn)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡
    5.4 △133p53在重編程過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂修復(fù)
    5.5 △133p53在重編程過(guò)程中保護(hù)基因組穩(wěn)定性
    5.6 細(xì)胞重編程后產(chǎn)生IPSC的鑒定
    5.7 在細(xì)胞重編程時(shí)△133p53的功能模型
    5.8 結(jié)果討論
6 △133p53提高機(jī)體在低劑量氧化環(huán)境中的適應(yīng)性
    6.1 △133p53在低劑量氧化環(huán)境中被誘導(dǎo)表達(dá)
    6.2 △133p53優(yōu)化細(xì)胞對(duì)低劑量氧化環(huán)境的適應(yīng)性
    6.3 △113p53優(yōu)化斑馬魚(yú)對(duì)低劑量氧化環(huán)境的適應(yīng)性
    6.4 △133p53降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平
    6.5 △133p53通過(guò)調(diào)節(jié)抗ROS基因的表達(dá)從而降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平
    6.6 △133p53直接參與抗ROS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    6.7 機(jī)體應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期低劑量氧化環(huán)境的可能的策略模型
    6.8 結(jié)果討論
7 在高溫下p53抑制過(guò)度的CMA保護(hù)細(xì)胞免于死亡
M214K突變品系比野生型斑馬魚(yú)對(duì)于40℃相對(duì)高溫更敏感">    7.1 p53^M214K突變品系比野生型斑馬魚(yú)對(duì)于40℃相對(duì)高溫更敏感
    7.2 p53缺陷細(xì)胞系比p53正常細(xì)胞系對(duì)于40℃相對(duì)高溫更敏感
    7.3 p53缺陷細(xì)胞系比p53正常細(xì)胞系對(duì)于40℃相對(duì)高溫更敏感不是由細(xì)胞凋亡、壞死和大自噬導(dǎo)致
    7.4 p53缺陷細(xì)胞系比p53正常細(xì)胞系對(duì)于40℃相對(duì)高溫更敏感是由CMA導(dǎo)致
    7.5 p53通過(guò)p53-HSF1-HSC70信號(hào)通路抑制CMA,從而在40℃相對(duì)高溫下保護(hù)人類細(xì)胞免于死亡
    7.6 p53通過(guò)p53-HSF1-HSC70信號(hào)通路抑制CMA,從而在40℃相對(duì)高溫下保護(hù)斑馬魚(yú)免于死亡
    7.7 p53在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控HSF1表達(dá)
    7.8 p53在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控HSF1表達(dá)的分子機(jī)制
    7.9 p53缺陷移植瘤細(xì)胞對(duì)40℃相對(duì)高溫處理較p53正常細(xì)胞敏感
    7.10 結(jié)果討論
8 研究總結(jié)
    8.1 結(jié)論與意義
    8.2 課題展望
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介
致謝



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