發(fā)布時(shí)間：2024-02-24 03:36

　　基因組靶向修飾技術(shù)對(duì)基因功能研究、基因治療以及轉(zhuǎn)基因育種研究等都具有重要的意義和價(jià)值,其中,特異性核酸內(nèi)切酶的開(kāi)發(fā)是基因組靶向修飾研究中的關(guān)鍵。鋅指核酸酶(ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)的發(fā)展為基因組靶向修飾研究提供了有效的技術(shù)手段。但是,特異性高效ZFNs的復(fù)雜篩選和TALENs的繁瑣組裝過(guò)程依舊是一個(gè)重大的技術(shù)挑戰(zhàn),并嚴(yán)重制約著動(dòng)物基因編輯育種研究等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展速度;因此,亟待開(kāi)發(fā)一種經(jīng)濟(jì)高效、簡(jiǎn)單快捷、能夠應(yīng)用于哺乳動(dòng)物的特異性核酸內(nèi)切酶技術(shù)。2012年,源于釀膿鏈球菌的II型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)被首次在體外研究中應(yīng)用于DNA分子的靶向切割,引發(fā)了業(yè)界的廣泛關(guān)注。而早在2011年,嗜熱鏈球菌的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)CRISPR3就已經(jīng)被證明能在大腸桿菌中特異性的切割外源質(zhì)粒DNA。本研究在這種背景下展開(kāi),我們希望以嗜熱鏈球菌CRISPR3系統(tǒng)為基礎(chǔ),開(kāi)發(fā)一種新型的核酸酶技術(shù),為以后進(jìn)一步的基因組靶向修飾和動(dòng)物基因編輯育種研究奠定基礎(chǔ)。本研究中我們首先成功克隆得到了嗜熱鏈球菌的Cas9基因并成功實(shí)現(xiàn)了其在酵母中的表達(dá)。然后我們相繼建立了酵母...

【文章頁(yè)數(shù)】：128 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 基因組靶向修飾
    1.2 FokI介導(dǎo)的核酸酶技術(shù)
        1.2.1 鋅指核酸酶技術(shù)
        1.2.2 TALE核酸酶技術(shù)
    1.3 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)
        1.3.1 細(xì)菌CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)
        1.3.2 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的體外研究
        1.3.3 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的迅速崛起
        1.3.4 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)
        1.3.5 CRISPR/Cas9衍生技術(shù)的開(kāi)發(fā)
        1.3.6 不同來(lái)源的CRISPR/Cas平臺(tái)開(kāi)發(fā)
    1.4 本研究的目的意義
第二章 酵母StCRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 菌種與培養(yǎng)基
        2.1.2 主要試劑和儀器
        2.1.3 引物序列
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 bStCas9基因克隆和酵母表達(dá)載體構(gòu)建
        2.2.2 StCas9蛋白在酵母中的表達(dá)檢測(cè)
        2.2.3 導(dǎo)向RNA酵母表達(dá)載體構(gòu)建
        2.2.4 導(dǎo)向RNA分子的設(shè)計(jì)
        2.2.5 基于Gal4的酵母報(bào)告載體構(gòu)建
        2.2.6 Gal4報(bào)告載體自修復(fù)效率檢測(cè)試驗(yàn)
        2.2.7 StCRISPR/Cas9系統(tǒng)活性驗(yàn)證酵母轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
        2.2.8 Gal4報(bào)告基因的修復(fù)檢測(cè)
    2.3 試驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 bStCas9基因的克隆及表達(dá)
        2.3.2 Gal4報(bào)告載體自修復(fù)效率檢測(cè)結(jié)果
        2.3.3 StCRISPR/Cas9系統(tǒng)在酵母中的活性驗(yàn)證
        2.3.4 Gal4報(bào)告基因的修復(fù)檢測(cè)
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
第三章 酵母中StCRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗(yàn)材料
        3.1.2 酵母轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
        3.1.3 sgRNA不同結(jié)構(gòu)域的優(yōu)化
        3.1.4 StCRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)研究
        3.1.5 StCRISPR/Cas9靶序列偏好性研究
        3.1.6 PAM序列的研究
        3.1.7 sgRNA的優(yōu)化設(shè)計(jì)和功能驗(yàn)證
        3.1.8 StCas9密碼子優(yōu)化和功能驗(yàn)證
    3.2 試驗(yàn)結(jié)果
        3.2.1 sgRNA不同結(jié)構(gòu)域的優(yōu)化結(jié)果
        3.2.2 StCRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)研究結(jié)果
        3.2.3 StCRISPR/Cas9靶序列偏好性研究結(jié)果
        3.2.4 PAM序列的研究結(jié)果
        3.2.5 優(yōu)化后sgRNA的功能驗(yàn)證
    3.3 討論
    3.4 本章小結(jié)
第四章 StCRISPR/Cas9系統(tǒng)酵母基因組打靶驗(yàn)證
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗(yàn)材料
        4.1.2 整合型Gal4報(bào)告載體構(gòu)建
        4.1.3 酵母報(bào)告菌株構(gòu)建
        4.1.4 酵母報(bào)告菌株轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
        4.1.5 基因組中Gal4基因的修復(fù)檢測(cè)
    4.2 試驗(yàn)結(jié)果
        4.2.1 酵母報(bào)告菌株的構(gòu)建和鑒定
        4.2.2 不同SSA同源臂長(zhǎng)度的報(bào)告菌株比較
        4.2.3 基因組中Gal4基因修復(fù)的檢測(cè)結(jié)果
        4.2.4 StCRISPR/Cas9酵母基因組水平的打靶驗(yàn)證
    4.3 討論
    4.4 本章小結(jié)
第五章 哺乳動(dòng)物StCRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立
    5.1 試驗(yàn)材料
        5.1.1 細(xì)胞系與培養(yǎng)基
        5.1.2 主要試劑和儀器
        5.1.3 引物序列
    5.2 試驗(yàn)方法
        5.2.1 StCas9哺乳動(dòng)物表達(dá)載體構(gòu)建
        5.2.2 不同策略的導(dǎo)向RNA表達(dá)載體構(gòu)建
        5.2.3 SSA介導(dǎo)的eGFP報(bào)告載體構(gòu)建
        5.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)
        5.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與分析
    5.3 試驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 哺乳動(dòng)物StCRISPR/Cas9活性驗(yàn)證系統(tǒng)的建立
        5.3.2 不同導(dǎo)向RNA表達(dá)策略的比較
        5.3.3 優(yōu)化后sgRNA.Opti在HEK293中的活性驗(yàn)證
        5.3.4 StCRISPR/Cas9對(duì)鼠ROSA26靶序列的打靶驗(yàn)證
    5.4 討論
    5.5 本章小結(jié)
第六章 StCRISPR/Cas9系統(tǒng)HEK293T細(xì)胞基因組打靶研究
    6.1 材料與方法
        6.1.1 試驗(yàn)材料
        6.1.2 整合型eGFP報(bào)告載體構(gòu)建
        6.1.3 HEK293T報(bào)告細(xì)胞系構(gòu)建
        6.1.4 HEK293T報(bào)告細(xì)胞系轉(zhuǎn)染試驗(yàn)
        6.1.5 報(bào)告細(xì)胞系中的基因組打靶檢測(cè)
        6.1.6 HEK293T內(nèi)源基因打靶載體構(gòu)建及活性驗(yàn)證
        6.1.7 RPG雙報(bào)告基因載體構(gòu)建
        6.1.8 HEK293T內(nèi)源基因打靶及突變檢測(cè)
    6.2 試驗(yàn)結(jié)果
        6.2.1 HEK293報(bào)告細(xì)胞系基因組打靶驗(yàn)證結(jié)果
        6.2.2 HEK293T內(nèi)源基因打靶載體活性驗(yàn)證結(jié)果
        6.2.3 核酸酶陽(yáng)性細(xì)胞的RPG富集
        6.2.4 HEK293T內(nèi)源基因的突變檢測(cè)結(jié)果
    6.3 討論
    6.4 本章小結(jié)
結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄
縮略 詞
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3908459