發(fā)布時間：2024-05-23 03:53

　　低溫是細菌生存面臨的一種主要環(huán)境脅迫因素。細菌急性暴露于低溫環(huán)境時,為應對這種變化細胞將產生一系列的級聯(lián)反應,即冷激反應。在冷激反應中會大量誘導合成一類小分子蛋白質家族統(tǒng)稱為冷激蛋白(cold shock proteins,Csps)。大量的實驗表明,冷激蛋白在適應低溫脅迫和正常生長過程中都起到重要作用。耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)能生存于多種極端環(huán)境,但其冷脅迫的應答反應尚不清楚,特別是冷激蛋白Csp介導的調控機制報道甚少。本研究以耐輻射異常球菌作為研究對象,利用RNA-Seq技術測定正常和冷激條件下野生型菌株和csp突變株的轉錄組,并進一步用實時定量PCR驗證,測定其相關生理生化表型,探討了Csp的作用機制,取得如下結果:1.Western Blot結果顯示,Csp在冷激4 h后開始大量積累,具備冷激反應的基本特征。為了揭示耐輻射異常球菌冷激反應的過程,開展了該菌在正常條件和冷脅迫條件下(15°C,4 h)的轉錄組學測定,分析結果表明,冷脅迫導致199個基因表達上調,642個基因表達下調,其中包括了低溫信號感應,傳遞和應答的過程所涉及的代謝通路。...

【文章頁數】：108 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 細菌冷激反應的研究進展
        1.1.1 冷激反應的定義
        1.1.2 冷信號的感應和傳導
        1.1.3 冷激反應的功能
        1.1.4 冷激蛋白Csp的廣泛分布
        1.1.5 冷激蛋白Csp的結構特點
        1.1.6 冷激蛋白Csp的表達與功能
        1.1.7 細胞對冷激反應的調控
        1.1.8 冷激反應中的重要功能蛋白
    1.2 耐輻射異常球菌研究進展
        1.2.1 耐輻射異常球菌的分離及進化地位
        1.2.2 耐輻射異常球菌的特殊結構特征
        1.2.3 耐輻射異常球菌的極端抗性
        1.2.4 耐輻射異常球菌的損傷修復機制
        1.2.5 耐輻射異常球菌脅迫應答蛋白
        1.2.6 耐輻射細菌中的冷激蛋白
    1.3 轉錄組學關鍵技術及其在細菌功能基因組學研究中的應用
        1.3.1 RNA-seq是利用高通量對轉錄本進行測序分析的技術
        1.3.2 轉錄組學在細菌冷激反應全局調控研究中的應用
    1.4 立題依據和技術路線
        1.4.1 立題依據
        1.4.2 技術路線
第二章 耐輻射異常球菌冷激反應的轉錄組分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌株、質粒來源
        2.1.2 培養(yǎng)基、酶類及生化試劑
        2.1.3 主要儀器設備和軟件
        2.1.4 培養(yǎng)條件
        2.1.5 生長柱狀圖的繪制
        2.1.6 轉錄組學分析樣品的RNA制備
        2.1.7 轉錄組測序方法
        2.1.8 轉錄組學數據分析方法
        2.1.9 實時定量PCR驗證
        2.1.10 Western Blot檢測
    2.2 結果
        2.2.1 耐輻射異常球菌的低溫生長分析
        2.2.2 實時定量PCR檢測耐輻射異常球菌冷激條件下csp的表達
        2.2.3 Western Blot檢測耐輻射異常球菌冷激條件下Csp蛋白的表達
        2.2.4 耐輻射異常球菌冷激反應轉錄組概況
        2.2.5 耐輻射異常球菌冷激反應時高表達的基因
        2.2.6 耐輻射異常球菌冷激反應時表達上調的基因
        2.2.7 耐輻射異常球菌冷激反應時表達下調的基因
    2.3 討論
        2.3.1 耐輻射異常球菌具有典型的冷激反應
        2.3.2 耐輻射異常球菌冷激反應關鍵基因的分析
        2.3.3 耐輻射異常球菌冷激反應激活UvrABC途徑
        2.3.4 耐輻射異常球菌冷激反應時維持細胞膜的結構
        2.3.5 耐輻射異常球菌冷激反應時抗氧化酶被激活
        2.3.6 耐輻射異常球菌冷激反應過程
第三章 耐輻射異常球菌突變株△csp及回補株△cspC的表型分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 菌株、質粒來源
        3.1.2 培養(yǎng)基、酶類及生化試劑
        3.1.3 培養(yǎng)條件
        3.1.4 細菌基因組及質粒的提取
        3.1.5 PCR反應
        3.1.6 DNA目的片段的切膠回收
        3.1.7 DNA片段的酶切與連接
        3.1.8 大腸桿菌感受態(tài)細胞的化學轉化法
        3.1.9 生長曲線的測定
        3.1.10過氧化氫沖擊后存活率的分析
        3.1.11 Western Blot實驗
    3.2 結果
        3.2.1 Csp的生物信息學分析
        3.2.2 耐輻射異常球菌突變株 Δcsp特征及回補株 ΔcspC的構建
        3.2.3 實時定量PCR檢測耐輻射異常球菌不同生長時期csp的表達
        3.2.4 Western Blot檢測耐輻射異常球菌不同生長時期Csp蛋白的表達
        3.2.5 耐輻射異常球菌野生型及其突變株和回補株的生長曲線分析
        3.2.6 耐輻射異常球菌野生型及其突變株和回補株的過氧化氫抗性分析 . 563.3 討論
    3.3 討論
        3.3.1 耐輻射異常球菌Csp在穩(wěn)定期的積累
        3.3.2 耐輻射異常球菌冷激蛋白Csp參與穩(wěn)定期脅迫反應
        3.3.3 耐輻射異常球菌冷激蛋白Csp參與氧化沖擊的響應
        3.3.4 耐輻射異常球菌冷激蛋白Csp參與磷酸戊糖途徑的調節(jié)
第四章 耐輻射異常球菌Csp介導的冷脅迫調控機制
    4.1 材料與方法
        4.1.1 菌株、質粒來源
        4.1.2 培養(yǎng)基、酶類及生化試劑
        4.1.3 培養(yǎng)條件
        4.1.4 PCR反應
        4.1.5 蛋白三維結構的模擬
        4.1.6 啟動子的預測
        4.1.7 KEGG數據庫對代謝途徑的定位
        4.1.8 過氧化氫酶活性分析
    4.2 結果
        4.2.1 耐輻射異常球菌缺失csp對低溫存活的影響
        4.2.2 耐輻射異常球菌冷激反應中冷激蛋白Csp調控基因的預測
        4.2.3 冷脅迫條件下，Csp調控途徑的預測
        4.2.4 冷脅迫條件下，Csp增強麥芽糖轉運基因的表達
        4.2.5 冷脅迫條件下，Csp增強抗氧化酶相關基因的表達
        4.2.6 冷脅迫條件下過氧化氫酶活性的變化
    4.3 討論
        4.3.1 csp缺失對細胞低溫存活的影響
        4.3.2 Csp對麥芽糖轉運的調控作用
        4.3.3 Csp對AsnC家族轉錄調節(jié)因子的調控作用
        4.3.4 Csp對過氧化氫酶基因katA的調控模型
        4.3.5 Csp對耐輻射異常球菌冷激反應的調控
第五章 結論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3980965