發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 06:47

　　 目的:探討砷氟聯(lián)合暴露誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞損傷及凋亡的特征;闡明自噬在砷氟暴露致心臟毒性過程中的相關(guān)機(jī)制,以及在此過程中砷和氟之間的互作關(guān)系。方法:本研究選取大鼠H9c2心肌細(xì)胞作為研究對(duì)象。根據(jù)2×3析因設(shè)計(jì),共分為9組:對(duì)照組(0μM NaAsO_2,0mg/L NaF,C組)、高砷高氟組(25μM NaAsO_2,35mg/L NaF,As_(25)F_(35)組)、高砷低氟組(25μM NaAsO_2,10mg/L NaF,As_(25)F_(10)組)、低砷高氟組(10μM NaAsO_2,35mg/L NaF,As_(10)F_(35)組)、低砷低氟組(10μM NaAsO_2,10mg/L NaF,As_(10)F_(10)組)、高氟組(35mg/L NaF,F_(35)組)、低氟組(10mg/L NaF,F_(10)組)、高砷組(25μM NaAsO_2,As_(25)組)、低砷組(10μM NaAsO_2,As_(10)組)。細(xì)胞在染毒24h后,1.采取CCK8及MTT方法測(cè)定砷氟暴露后細(xì)胞的存活率。2.使用倒置顯微鏡觀察砷氟暴露后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、形態(tài)及數(shù)量的變化。3.通過HE染色在光鏡下觀察砷氟暴露后細(xì)胞的損傷程度。4.使用透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、自噬體等超微結(jié)構(gòu)的改變。5.采用流氏細(xì)胞術(shù)測(cè)定砷氟暴露后細(xì)胞早期、晚期、總凋亡率及胞內(nèi)ROS的含量。6.采用qRT-PCR法測(cè)定自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3、p62的mRNA表達(dá)水平。7.采用Western Blotting測(cè)定自噬標(biāo)志分子Beclin1、LC3-Ⅱ、p62的蛋白表達(dá)水平。8.免疫熒光法測(cè)定自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、p62的表達(dá)水平。9.采用兩因素三水平析因分析判定所有結(jié)果中砷與氟之間的交互作用關(guān)系。結(jié)果:1.砷氟聯(lián)合暴露后細(xì)胞存活率及凋亡率變化:(1)CCK8及MTT結(jié)果顯示,隨著砷氟暴露劑量及染毒時(shí)間的增加,細(xì)胞存活率逐漸下降。砷氟聯(lián)合暴露后,細(xì)胞存活率由高至低分別為:F_(10)F_(35)As_(10)As_(10)F_(10)As_(10)F_(35)As_(25)As_(25)F_(10)As_(25)F_(35)。其中在暴露24h后,As_(25)F_(35)組、As_(25)F_(10)組的細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組(p0.001或p0.01)。(2)As_(25)F_(35)組早期凋亡率及總凋亡率最高。2.砷氟聯(lián)合暴露后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)結(jié)構(gòu)變化:(1)鏡下觀察及HE染色結(jié)果顯示,氟暴露細(xì)胞形態(tài)更細(xì)長(zhǎng),而砷暴露后細(xì)胞體積明顯縮小。與對(duì)照組相比,As_(25)F_(35)組、As_(25)F_(10)組、As_(25)組細(xì)胞排列紊亂,數(shù)量減少,細(xì)胞生長(zhǎng)狀況較差。(2)超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示,線粒體在砷氟暴露組中出現(xiàn)不同程度的空泡化現(xiàn)象;As_(25)及As_(25)F_(35)組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯腫脹。3.砷氟聯(lián)合暴露后細(xì)胞氧化損傷指標(biāo)結(jié)果:ROS含量在As_(25)F_(35)組、As_(25)F_(10)組、As_(25)組及F_(35)組中顯著升高(As_(25)F_(35)、As_(25)F_(10)、As_(25):p0.001,F_(35):p0.01),而在As_(10)F_(35)組、As_(10)F_(10)組及As_(10)組中ROS含量顯著低于對(duì)照組(As_(10)F_(35):p0.01,As_(10)F_(10)、As_(10):p0.001)。4.砷氟聯(lián)合暴露后自噬相關(guān)分子表達(dá)水平及自噬體超微結(jié)構(gòu)變化:(1)自噬體在As_(25)F_(35)組、As_(25)組、As_(10)組細(xì)胞中分布較多,在As_(25)組細(xì)胞中,自噬體大都以單層膜自噬溶酶體存在。(2)LC3與p62的mRNA及蛋白表達(dá)水平在各組變化趨勢(shì)相同。其中,p62 mRNA及蛋白表達(dá)水平在As_(25)F_(35)組、As_(25)F_(10)組、As_(10)F_(35)組、As_(25)組及As_(10)組均顯著升高(p0.01)。LC3mRNA表達(dá)在As_(25)F_(35)組、As_(25)F_(10)組和As_(10)F_(35)組顯著升高(p0.05),其蛋白水平同樣在As_(25)F_(35)組、As_(25)F_(10)組、As_(10)F_(35)組以及As_(25)組中顯著升高(As_(25)F_(35)、As_(25)F_(10):p0.001,As_(10)F_(35)、As_(25):p0.05)。Beclin1蛋白表達(dá)水平在As_(25)F_(35)組及As_(10)組顯著升高(p0.01)。(3)p62及LC3的免疫熒光結(jié)果顯示,p62熒光半定量蛋白表達(dá)水平在As_(25)F_(35)組、As_(25)F_(10)組及As_(25)組中顯著升高(As_(25)F_(35):p0.05,As_(25)F_(10)、As_(25):p0.01)。LC3熒光半定量蛋白表達(dá)水平在As_(25)F_(35)組顯著升高(As_(25)F_(35):p0.05)。5.砷氟聯(lián)合暴露后析因分析結(jié)果:在存活率、總凋亡率、ROS含量、p62 mRNA及蛋白表達(dá)水平、Beclin1蛋白表達(dá)水平這些指標(biāo)中,砷和氟存在交互作用,主要表現(xiàn)為拮抗作用。但是兩者在Beclin1 mRNA表達(dá)水平、p62免疫熒光半定量蛋白、LC3mRNA、蛋白表達(dá)水平及免疫熒光半定量蛋白指標(biāo)中并未發(fā)現(xiàn)具有交互作用。結(jié)論:砷氟暴露可誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞發(fā)生損傷。當(dāng)砷氟濃度均處于高水平時(shí),細(xì)胞內(nèi)線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞,產(chǎn)生大量ROS,同時(shí)升高LC3和p62誘導(dǎo)自噬體生成、抑制自噬溶酶體降解,阻斷自噬流,參與了砷氟暴露引發(fā)的心臟毒性。在此過程中,砷氟之間可能存在拮抗作用。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文82結(jié)果2.1砷氟聯(lián)合暴露下H9c2心肌細(xì)胞存活率的測(cè)定2.1.1細(xì)胞存活率隨濃度及時(shí)間的變化圖1-1A和圖1-1B分別表示，在24h及48h染毒時(shí)間下，CCK8測(cè)定的細(xì)胞存活率隨砷和氟的染毒濃度的升高而降低。根據(jù)細(xì)胞存活率不低80%的要求，選定NaAsO2濃度為25μM，NaF濃度為35mg/L作為兩元素的高暴露水平，選取10μM及10mg/L作為低暴露水平，并對(duì)砷氟不同水平4個(gè)組之間進(jìn)行兩兩配對(duì)形成4個(gè)聯(lián)合組，并選定24h作為染毒時(shí)間。圖1-1C顯示了MTT測(cè)定暴露12h、24h、48h、72h和96h后各組細(xì)胞存活率的結(jié)果。如圖所示，隨著時(shí)間的增加，每個(gè)暴露組的細(xì)胞存活率均呈下降趨勢(shì)。各組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的存活率由高至低分別為：F10>F35>As10>As10F10>As10F35>As25>As25F10>As25F35。其中As25F35組細(xì)胞存活率最低。圖1-1砷氟單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響(x±s,n＝3)

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文92.1.2染毒24h后各組細(xì)胞存活率的變化MTT測(cè)定染毒24h后各組細(xì)胞存活率的變化，由圖1-2可知，與對(duì)照組相比，As25F35組和As25F10組染毒24h后心肌細(xì)胞存活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。其中As25F35組細(xì)胞存活率為66.2%，As25F10組為75.4%。圖1-2砷氟單獨(dú)及聯(lián)合暴露24h后H9c2心肌細(xì)胞的存活率(x±s,n＝3)2.2流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定砷氟聯(lián)合暴露下的細(xì)胞凋亡率通過流式細(xì)胞術(shù)，測(cè)定各組細(xì)胞的凋亡率，反映砷氟聯(lián)合暴露24h后H9c2心肌細(xì)胞的存活狀況。結(jié)果顯示（圖1-3），細(xì)胞的凋亡率隨著砷氟濃度的升高而升高。與對(duì)照組相比，各染毒組早期凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05或p<0.01或p<0.001）。其中As25F35組、As25F10組及As25組細(xì)胞早期凋亡率較高。而對(duì)于晚期凋亡而言，與對(duì)照組相比，8個(gè)染毒組同樣與對(duì)照組存在顯著性差異（p<0.05或p<0.001），不同的是砷氟單獨(dú)暴露條件下的晚期凋亡率高于兩者聯(lián)合暴露下的凋亡率，F(xiàn)35組的晚凋率最高。

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文10圖1-3流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定砷氟暴露24h后細(xì)胞的凋亡率(x±s,n＝3)2.3砷氟聯(lián)合暴露下H9c2心肌細(xì)胞鏡下觀察結(jié)果如圖1-4所示，對(duì)照組細(xì)胞密集，排列整齊，細(xì)胞呈長(zhǎng)條狀，生長(zhǎng)狀況良好。As10組細(xì)胞體積縮小，排列紊亂；As25組細(xì)胞體積明顯縮小，凋亡細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差�？梢�，砷暴露下，H9c2心肌細(xì)胞損傷程度較大。F10組無明顯差異，而F35組細(xì)胞形狀更為細(xì)長(zhǎng)，且凋亡細(xì)胞數(shù)量較多。砷氟聯(lián)合暴露情況下，As25F35組與As25F10組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差，其中As25F35組最嚴(yán)重，細(xì)胞形態(tài)明顯改變，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞排列紊亂。而As10F10組和As10F35組只有部分凋亡細(xì)胞，且與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)差異較校
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2892692