發(fā)布時間：2020-11-21 03:03

　　 目的:液相微萃取是在常規(guī)液液萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型樣品前處理技術(shù),集采樣、純化、富集于一體,并能適應(yīng)復(fù)雜基質(zhì)、痕量成分、特殊性質(zhì)成分的分析。為了進一步提高目標化合物的富集效率、減少有機溶劑的用量、提高檢測的靈敏度,我們擬對常規(guī)的微萃取模式進行改進,以建立更為簡單、高效、環(huán)境友好的新型液相微萃取方法,結(jié)合高效液相色譜法,實現(xiàn)對中藥材及其制劑樣品中活性成分的純化、濃集和高效測定。方法:以一種疏水性低共熔溶劑(四丁基氯化銨-己酸)作為萃取相和接受相分別填充于中空纖維的壁孔和管腔;將兩根纖維彎成U型浸入中藥樣品溶液中,于一定溫度下對四種肉桂酸類衍生物進行萃取、濃集,結(jié)合高效液相色譜-紫外檢測技術(shù)(HPLC-UVD)完成定量分析。由于纖維壁孔對生物大分子具有分離攔截作用,故將該方法用于血漿樣品中活性化合物-蛋白結(jié)合率的測定。試驗對微萃取和蛋白結(jié)合率測定的影響因素進行了優(yōu)化,對方法的效能指標進行了考察,并對其萃取機制和蛋白結(jié)合參數(shù)測定機制進行了探討和闡述。采用自制萃取裝置,將四丁基氯化銨和己酸制成的低共熔溶劑作為萃取劑加入樣品溶液中,以手搖方式提供分散動力,使低共熔溶劑形成細小液滴,達到與樣品溶液的最大接觸面積,完成目標化合物的萃取,最后通過離心實現(xiàn)相分離。試驗對萃取條件進行了優(yōu)化,并在最佳條件下進行了方法學(xué)考察,結(jié)合HPLC-UVD用于川芎和當(dāng)歸藥材中肉桂酸類衍生物的分離、濃集和測定,且進行了方法比較。結(jié)果:低共熔溶劑中空纖維液相微萃取的最佳萃取條件:萃取劑為1:3摩爾比的四丁基氯化銨-己酸;樣品相pH為2、鹽濃度為20%;萃取溫度為55℃;攪拌速度為800rpm;萃取40 min。此條件下,該方法對四種目標化合物的富集倍數(shù)在82-127之間;線性范圍分別為:咖啡酸0.002-5.6μg/mL、對羥基肉桂酸0.001-3.2μg/mL、阿魏酸0.0016-4.8μg/mL、肉桂酸0.0012-4μg/mL,相關(guān)系數(shù)均不低于0.9985,檢測限和定量限分別為0.1-0.3和0.4-1.0 ng/mL;日內(nèi)和日間精密度相對標準偏差分別為1.0%-6.1%和0.7%-6.0%;平均回收率在89.9%-105.2%之間。低共熔溶劑中空纖維液相微萃取結(jié)合HPLC-UVD測得川芎藥材中咖啡酸和阿魏酸的平均含量分別為64.1±2.4和928.9±27.1μg/g;脈絡(luò)寧注射液中咖啡酸、對羥基肉桂酸、阿魏酸和肉桂酸的平均含量分別為629.3±10.1、61.1±1.2、23.8±0.8和576.4±16.4μg/mL。此外,活性化合物與血漿蛋白結(jié)合時間為90 min,四種目標化合物的血漿蛋白結(jié)合率分別為39.3±1.4%、42.0±1.3%、52.9±2.6%和19.8±1.1%。低共熔溶劑分散液相微萃取的最佳萃取條件:萃取劑為150μL的四丁基氯化銨-己酸(1:2,n:n);樣品相調(diào)節(jié)至pH 3、鹽濃度15%;萃取15 s后,離心2 min實現(xiàn)相分離。此條件下,該方法對四種目標化合物的富集倍數(shù)分別為:咖啡酸135、對羥基肉桂酸171、阿魏酸146、肉桂酸220;線性范圍分別為0.02-8μg/mL、0.01-6.4μg/mL、0.016-7.2μg/mL、0.012-7.2μg/mL,相關(guān)系數(shù)均不低于0.9954,檢測限和定量限分別為0.2-0.4和0.6-1.4 ng/mL;日內(nèi)和日間精密度相對標準偏差分別為1.6%-7.2%和1.3%-8.5%;平均回收率在90.0%-104.6%之間。結(jié)合HPLC-UVD測得川芎藥材中咖啡酸和阿魏酸的平均含量分別為70.2±4.0和1004.1±40.9μg/g;當(dāng)歸藥材中阿魏酸的平均含量為1029.4±17.7μg/g。結(jié)論:本文建立了低共熔溶劑中空纖維液相微萃取、低共熔溶劑分散液相微萃取兩種新型液相微萃取方法。低共熔溶劑中空纖維液相微萃取使用的新型綠色萃取劑大大提高了傳統(tǒng)中空纖維液相微萃取對該類化合物的富集效率,同時還完成了活性化合物-血漿蛋白結(jié)合率的測定;低共熔溶劑分散液相微萃取在操作裝置和步驟上進行了較大程度的改進,具有操作簡便、富集效率高、環(huán)境友好等特點。本研究為建立更加綠色環(huán)保、簡單高效、經(jīng)濟適用的液相微萃取方法,做了積極有效的探索,并已結(jié)合HPLC-UVD成功用于復(fù)雜樣品(中藥、血漿)中肉桂酸類質(zhì)量標志物的萃取、濃集和測定。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R284
【部分圖文】：

本研究中的四種肉

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文1610空氣中晾干；潔凈的纖維剪成7cm小段備用。將纖維段放入DES中浸泡15min，待孔隙充滿溶液后取出，用紙巾擦除管腔外多余的液體。以注射器將甲醇稀釋后的DES（加甲醇以減小DES黏度，比例為15%，v/w）由纖維一端注入腔內(nèi)，直至另一端有溢出為止，兩端用棉線封口。1.2.2DES-HF-LPME測定中藥樣品含量過程取樣品溶液（或混合工作液）700μL、25%NaCl溶液5.6mL置于10mL樣品瓶中，用0.1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，放入磁力攪拌子。取兩根上述已制備好的纖維段，將其彎成U形，浸入樣品相中，于磁力攪拌器上55℃水浴800rpm下萃取40min。萃取完成后取出纖維，用吸水紙拭去纖維外壁多余的溶液，剪掉兩端封口，用微量注射器將腔內(nèi)的DES轉(zhuǎn)移到0.5mL的EP管中，再分別用20μL甲醇吹洗各個纖維內(nèi)腔，合并吹洗液，渦旋混勻。取20μL進行HPLC分析。所有萃取試驗均一式三份，操作過程見圖1-1。圖1-1DES-HF-LPME試驗過程示意圖1.2.3DES-HF-LPME測定活性化合物-血漿蛋白結(jié)合率過程取混合工作液700μL、空白血漿300μL置于10mL樣品瓶中。同時，取混合工作溶液700μL、10mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）300μL加入另一個樣品瓶中。兩組溶液分別加入磁力攪拌子于37℃水浴下孵育90min，然后用pH2的25%NaCl（w/v）溶液稀釋至7mL。兩組溶液各放入兩根已制備好的纖維段

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文18102結(jié)果2.1萃取條件優(yōu)化為獲得較高的萃取效率和檢測靈敏度，本試驗對影響DES-HF-LPME的各條件因素進行了考察和優(yōu)化。富集倍數(shù)（EF）是評價萃取方法對目標化合物富集能力的指標參數(shù)，為萃取達平衡后萃取相中目標化合物的濃度（Ce）與樣品相中目標化合物的初始濃度（C0）的比值：EF=CeC0。2.1.1萃取劑種類及組成本試驗考察了七種不同的疏水性DES：DES1、DES2、DES3、DES4、DES5、DES6、DES7分別對目標化合物EFs的影響。結(jié)果如圖1-2A所示，DES5（四丁基氯化銨-己酸）對四種目標化合物的富集效率明顯高于其他種類的DES，因此選擇DES5作為DES-HF-LPME的萃取溶劑。此外，還考察了四丁基氯化銨和己酸在不同摩爾比（3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）的情況下對目標化合物EFs的影響。結(jié)果如圖1-2B所示，當(dāng)四丁基氯化銨和己酸的摩爾比為1:3時富集效率最高。圖1-2萃取劑種類（A）及比例（B）對目標化合物富集倍數(shù)的影響化合物濃度，0.8μg/mL；樣品相體積，7mL，pH=2；鹽濃度，20%；萃取溫度，55℃；攪拌速度，800rpm；萃取40min（n=3）
【參考文獻】

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本文編號：2892425