發(fā)布時(shí)間：2017-12-09 08:36

  本文關(guān)鍵詞：山葡萄U-box蛋白基因VaPUB的克隆和功能研究

  更多相關(guān)文章： U-box蛋白 葡萄 擬南芥 低溫 霜霉病

【摘要】：U-box型泛素連接酶在植物抗逆和生長發(fā)育等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。前期,本課題組構(gòu)建了山葡萄'左山一'葉片的低溫差減文庫。本研究對(duì)文庫中一個(gè)高表達(dá)的新基因進(jìn)行了克隆,并采用分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段對(duì)該基因的功能進(jìn)行了研究,以期為揭示葡萄抗逆機(jī)制和開展抗性育種工作提供新的理論依據(jù)。根據(jù)序列分析結(jié)果,該基因編碼的蛋白具有U-box功能域,因此命名為PUB(Plant U-box Protein)。多序列比對(duì)結(jié)果表明,山葡萄VaPUB與多個(gè)物種中的U-box泛素連接酶和病原菌快速響應(yīng)蛋白CMPG1具有很高的氨基酸序列相似性。利用熒光定量PCR分析基因表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)PUB在山葡萄'左山一'根、莖、莖尖、葉中均穩(wěn)定表達(dá)。PUB的表達(dá)受到低溫、霜霉菌、SA、ABA的顯著調(diào)控,但在不同葡萄品種中的表達(dá)趨勢不同。對(duì)PUB啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)不同葡萄品種間存在單核苷酸突變,這說明基因在不同葡萄品種中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式可能存在差異。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮浸沾法,獲得了過表達(dá)VaPUB的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)VaPUB顯著提高了擬南芥的抗寒性和耐鹽性,但是對(duì)擬南芥的根系生長、抗旱性、和對(duì)霜霉病的抗性沒有顯著的影響。對(duì)冷誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)VaPUB顯著提高了 ICE-CBF 通路正調(diào)控基因CBF1/DREB1B、CBF3/DREBIA、COR15A、KIN1 和 SuSy 的表達(dá)水平,抑制了CBF2/DREB1 和MYB15的表達(dá)。為了更深入、直接的研究VaPUB在葡萄中的生物學(xué)功能,該基因被轉(zhuǎn)入Vitis vinifera'Thompson Seedless'。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因葡萄葉片氣孔開合程度變大,葉片上表皮層變薄,柵欄細(xì)胞不規(guī)則且松散排列,海綿層空隙變寬,并且葉片總?cè)~綠素的含量顯著減少。霜霉菌接種實(shí)驗(yàn)表明,霜霉菌在轉(zhuǎn)基因葉片上生長更快。采用雙向凝膠電泳檢測差異蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因葉片中39個(gè)蛋白的積累發(fā)生了顯著改變,這包括抗性蛋白PR10、幾丁質(zhì)酶,碳代謝相關(guān)蛋白,氧化反應(yīng)相關(guān)蛋白和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,VaPUB定位于細(xì)胞核。此外,本研究采用了 Microvine葡萄轉(zhuǎn)基因體系,Microvine具有矮化和短周期內(nèi)獲得果實(shí)的特點(diǎn)。VaPUB轉(zhuǎn)基因Microvine株系的獲得為開展基因在果實(shí)中的研究工作打下了重要的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2;S663.1

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 彭浩;宋文路;王曉強(qiáng);趙強(qiáng);王超;;水楊酸與植物抗逆性關(guān)系研究進(jìn)展[J];園藝與種苗;2016年02期

2 和靜;李瑞民;王躍進(jìn);;野生毛葡萄芪合成酶基因雙向啟動(dòng)子活性分析[J];果樹學(xué)報(bào);2016年02期

3 Neila Jellouli;Asma Ben Salem;Abdelwahed Ghorbel;Hatem Ben Jouira;;Evaluation of Protein Extraction Methods for Vitis vinifera Leaf and Root Proteome Analysis by Two-Dimensional Electrophoresis[J];Journal of Integrative Plant Biology;2010年10期

4 秦川;張媛;;模式植物擬南芥的研究進(jìn)展[J];中學(xué)生物教學(xué);2009年09期

5 徐平麗;張傳坤;孫萬剛;單雷;李新國;;模式植物擬南芥基因組研究進(jìn)展[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年06期

6 吳耀榮;謝旗;;ABA與植物脅迫抗性[J];植物學(xué)通報(bào);2006年05期

7 葉興國,Shirley Sato,徐惠君,杜麗璞,Tom Clemente;小麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株的穩(wěn)定獲得和檢測[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2001年05期

8 徐淑平,衛(wèi)志明;基因槍的使用方法介紹[J];植物生理學(xué)通訊;1998年01期

，

本文編號(hào)：1269768