發(fā)布時間：2021-08-05 16:44

  Myostatin (MSTN)是肌肉生長發(fā)育的關(guān)鍵抑制因子。牛、羊、狗和人的MSTN基因突變后會表現(xiàn)出肌肉肥大的現(xiàn)象,又稱雙肌(DM)表型,然而到目前為止未見有關(guān)豬MSTN突變與明顯肌肉表型的報道。豬不僅是肉產(chǎn)品的重要來源,而且也是人類疾病研究的理想動物模型。為了研究MSTN突變對豬骨骼肌發(fā)育的影響,我們利用無標記基因的鋅指核酸酶技術(shù)(zFN)結(jié)合體細胞克隆技術(shù)成功制備并獲得了MSTN基因編輯梅山豬。我們首先通過分離培養(yǎng)獲得梅山豬的原代胎兒成纖維細胞,利用核轉(zhuǎn)染方法將MSTN的特異ZFN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到原代胎兒成纖維細胞中。培養(yǎng)24小時后,收集細胞并提取總DNA,利用PCR擴增打靶區(qū)域的核酸序列進行TA克隆測序用于檢測打靶效率；隨機挑取了1000個單菌落進行菌落PCR測序,共鑒定出40個MSTN突變序列,由此判定該ZFN質(zhì)粒在梅山豬胎兒成纖維細胞中的打靶效率約為4%。隨后,利用上述方法轉(zhuǎn)染細胞后,在沒有任何藥物篩選標記的情況下我們通過有限稀釋法獲取單細胞克隆。整個實驗中共收集并鑒定了約1800個單細胞克隆,獲得80個MSTN基因突變的細胞克隆,其中78個為單等位基因突變(MSTN+/+),2個為雙等位基因突變(MSTN-/-),所有突變中有超過90%的突變?yōu)樾∮?0bp的短片段缺失或插入。從中挑選了14個單細胞克隆用于體細胞克隆實驗,經(jīng)徒手克隆獲得2631枚重構(gòu)胚用于胚胎移植,共移植28頭受體母豬,其中有10頭母豬懷孕,7頭正常生產(chǎn),共獲得19頭活仔；最終有8頭來自105細胞系、1頭來自110細胞系的MSTN基因編輯克隆豬存活并繁育后代。最初獲得的MSTN基因編輯克隆豬為MSTN單等位基因突變型(MSTN+/-),經(jīng)過兩次自然交配獲得MSTN純合子突變(MSTN-/-)梅山豬。通過對后代個體的MSTN基因靶位點區(qū)域的測序分析證明經(jīng)ZFN編輯后的基因突變可穩(wěn)定遺傳給后代,并且符合孟德爾遺傳定律。同時,我們利用熒光定量PCR、Western blot及ELISA等方法對F2代三種基因型梅山豬MSTN基因的轉(zhuǎn)錄及表達情況進行了檢測,結(jié)果顯示MSTN梅山豬骨骼肌中的MSTN基因轉(zhuǎn)錄后發(fā)生錯誤拼接無法獲得有功能的myostatin蛋白。通過對克隆豬及其后代的觀察和屠宰檢測發(fā)現(xiàn),MSTN基因編輯豬生長發(fā)育正常,與MSTN梅山豬相比其胴體的肌肉量明顯增多(MSTN-/-:p0.01;MSTN+/-:p0.05)、脂肪量則明顯減少(MSTN-/-:p0.001; MSTN+/-:p0.05);而且MSTN-/-梅山豬表現(xiàn)出明顯的雙肌型,8月齡MSTN-/-個體的瘦肉率比野生型梅山豬高出11.62%,個別肌肉塊的重量由于肌纖維的增多可達到野生對照豬的兩倍。除此之外,在本研究中我們還發(fā)現(xiàn)約有20%的MSTN-編輯梅山豬表現(xiàn)多—個胸椎的現(xiàn)象。MSTN基因編輯豬的成功制備不僅為提高國內(nèi)地方脂肪型豬的瘦肉率提供了一種快速的遺傳改良方法,而且該基因編輯豬有望成為肌骨系統(tǒng)形成、發(fā)育及其相關(guān)疾病研究的理想的大動物模型。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828;Q78

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本文編號：1757473