楊梅是我國南方重要的商業(yè)化種植的亞熱帶水果,擁有豐富的楊梅種質(zhì)資源。由于基因組信息匱乏,楊梅相關(guān)分子生物學(xué)研究起步較晚,現(xiàn)主要集中在果實品質(zhì)和雌株栽培品種間遺傳多樣性研究。栽培楊梅為二倍體(2n=16)雌雄異株植物,有關(guān)雄株遺傳多樣性、雌雄性別分化研究較少。在生產(chǎn)中偶爾出現(xiàn)雌花突變?yōu)樾刍ìF(xiàn)象,但是其轉(zhuǎn)變機制還未得到闡述。為此本研究利用Illumina Hiseq 2000和PacBio測序平臺對楊梅進行全基因組測序、從前期鳥槍法對全基因組測序序列中開發(fā)SSR引物以及利用RAD-seq測序技術(shù)構(gòu)建了楊梅高密度遺傳連鎖圖譜;分析了雌、雄品系群體間的遺傳群體結(jié)構(gòu)、利用small RNA測序分析了荸薺雌花、荸薺突變雄花和雌雄同花間差異表達的miRNA。研究結(jié)果如下:1)基于楊梅全基因組鳥槍法測序數(shù)據(jù),開發(fā)了107對新的SSR標(biāo)記,用于遺傳多樣性分析、品種鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建。在測試的45份楊梅品系材料上,共擴增出828個等位基因,平均每個標(biāo)記有8個等位基因。有效等位基因數(shù)(Ne)范圍為1.22到10.41,平均為4.08。標(biāo)記多態(tài)性信息含量范圍為0.13至0.89,平均為0.63。107對SSR標(biāo)記在青楊梅和蠟楊梅的擴增率為96.2%和88.8%,在近緣種青楊梅和蠟楊梅通用性較高。共有78個位點在品種'荸薺'或者'東魁'為雜合狀態(tài),可選用于構(gòu)建'荸薺'×'東魁'的遺傳連鎖圖譜。利用鄰接法分析了45份楊梅材料的親緣關(guān)系,鑒定優(yōu)選單株'Y2010-70'和'Y2012-145'為楊梅新品系,以及無性系材料'Y2012-140'審定為新品種'夏至紅'。'Y2012-145'的純合度較高,適于開展全基因組測序。2)以水晶楊梅優(yōu)系'Y2012-145'為材料對其進行全基因組測序,同時對根、莖、葉、花和果實進行轉(zhuǎn)錄組測序。測序結(jié)果顯示楊梅基因組大小為322.7 Mb,基因組組裝得到962 條 scaffold 和 2939 條 contig(2 k),scaffold N50 和 contig N50 長度分別為:635.18 kb和192.56kb,平均GC含量為36.9%,平均覆蓋深度達到300X以上。楊梅基因組的重復(fù)序列大小為110Mb,占拼接基因組的35.4%,其中轉(zhuǎn)座因子占重復(fù)序列的95.6%。楊梅基因組預(yù)測有29,414個基因,其中能注釋功能的有26,316個,占89.47%。楊梅全基因組共鑒定了13,432個基因家族,其中特有的家族962個。共鑒定出50條MADS-box基因家族,其中14條在花芽中大量表達。3)利用RAD-seq測序原理,通過生物信息學(xué)分析,在兩個親本'荸薺'、'東魁'和101個F1代個體中共檢測到8461個多態(tài)性SNP位點。經(jīng)過卡方檢驗后有4441個SNP標(biāo)記符合孟德爾分離比率(P0.05),利用JoinMap4.1作圖軟件構(gòu)建楊梅高密度遺傳連鎖圖譜,包含8條連鎖群,總遺傳距離為563.01 cM,有1132個SNP和38個SSR標(biāo)記,標(biāo)記間平均距離為0.48 cM。4)利用84個SSR標(biāo)記對來自6個省市的213份楊梅材料(包括99份雄株113份雌株以及1份雌雄同株材料)和3份近緣種進行遺傳多樣性分析。鄰接法(Neighbour-joining)聚類分析結(jié)果將楊梅種與3個近緣種區(qū)分開,同時將楊梅雄株與雌株分開。STRUCTURE結(jié)果分析將213份楊梅材料劃分為兩個亞群:雄株為主種群(98份)、雌株為主種群(80份)。二次群體結(jié)構(gòu)分析可將雄株為主種群進一步劃分為4個群體:混合雄株群、混合性別群、浙江雄株群和東魁品種群。雌株種群可進一步劃分為荸薺品種群和粉紅品種群兩個群體。浙江省楊梅具有廣泛的遺傳多樣性,'荸薺'、'東魁'和'粉紅'品種分別被劃分到不同的品種群中,我們推斷浙江省是楊梅栽培起源中心。雌株群體遺傳多樣性指標(biāo)比雄株群體的稍高,但沒有顯著差異。在95%置信度水平上,發(fā)現(xiàn)2個SSR位點ZJU062和ZJU130的Fst值(遺傳分化系數(shù))為0.455和0.333,這兩個位點導(dǎo)致雌雄性別群體的遺傳結(jié)構(gòu)分離,因此推斷ZJU062和ZJU130與性別相關(guān)。ZJU062和ZJU130分別定為于LG5的scaffold__1004和LG2的scaffold_91上。本研究為楊梅雌雄株遺傳多樣性研究提供基礎(chǔ)同時也為性別控制基因組位置和楊梅育種提供相關(guān)參考信息。5)對楊梅品種'荸薺'的雌花、'荸薺'突變的雄花和雌雄同株花序中表達的sRNA進行高通量測序和降解組測序。3個sRNA文庫中分別獲得測序數(shù)量為12104480條,12242575條和11911476條。共鑒定出194條保守的miRNA,隸屬于32個miRNA家族,以及預(yù)測出 33 條新的 miRNA。5 個保守的 miRNA 家族(miR156、miR157、miR166、miR167 和miR168)在3個花序文庫中表達豐度高。共有46個uniquemiRNAs在雌花、雄花和雌雄同株中差異表達。通過降解組共鑒定出65條靶基因,45條靶基因獲得GO注釋信息,11條靶基因參與7條KEGG代謝通路。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S667.6
文章目錄
致謝
摘要
Abstract
縮略語表
1 引言
1.1 楊梅種質(zhì)資源和基因組學(xué)研究
1.1.1 楊梅科分類及分布現(xiàn)狀
1.1.2 楊梅品種選育研究進展
1.1.3 楊梅遺傳多樣性研究進展
1.1.4 楊梅基因組學(xué)研究進展
1.2 果樹高密度遺傳圖譜構(gòu)建
1.2.1 果樹RAD-seq高密度遺傳圖譜構(gòu)建的原理
1.2.2 常見果樹高密度遺傳圖譜構(gòu)建研究
1.2.3 楊梅遺傳圖譜構(gòu)建基礎(chǔ)
1.3 重要果樹全基因組測序進展
1.4 常見雌雄異株模式植物性別決定機制的研究
1.4.1 性染色體進化
1.4.2 模式植物性別分化機制
1.4.3 分子標(biāo)記在植物性別決定研究中的應(yīng)用
1.4.4 microRNAs（miRNAs）參與調(diào)控植物性別分化
1.5 立題依據(jù)及主要內(nèi)容
2 基于楊梅基因組SSR引物開發(fā)
2.1 材料和方法
2.1.1 植物材料和基因組DNA的提取
2.1.2 SSR引物設(shè)計
2.1.3 PCR反應(yīng)程序和體系
2.1.4 數(shù)據(jù)分析
2.2 結(jié)果
2.2.1 SSR標(biāo)記的遺傳多樣性
2.2.2 親緣關(guān)系分析
2.2.3 品種鑒定
2.3 討論
2.3.1 SSR多態(tài)性評價
2.3.2 親緣關(guān)系分析
2.3.3 品種鑒定
2.3.4 楊梅雜交育種實驗
2.3.5 低雜合度楊梅種質(zhì)材料的篩選
2.4 小結(jié)
3 楊梅全基因組測序
3.1 材料
3.2 方法
3.2.1 基因組文庫構(gòu)建和測序
3.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建和測序
3.2.3 基因組序列拼接
3.2.4 基因組重復(fù)序列注釋
3.2.5 基因預(yù)測和注釋
3.2.6 MADS-box基因家族全基因組鑒定
3.3 結(jié)果
3.3.1 測序策略和數(shù)據(jù)統(tǒng)計
3.3.2 基于k-mer評估基因組大小
3.3.3 基因組拼接組裝
3.3.4 基因組GC含量分析
3.3.5 測序深度分析
3.3.6 基因組重復(fù)序列
3.3.7 基因組預(yù)測和功能注釋
3.3.8 基因家族鑒定
3.3.9 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系
3.3.10 5個轉(zhuǎn)錄組特有的基因表達
3.3.11 MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的鑒定
3.3.12 與楊梅果實品質(zhì)相關(guān)的代謝途徑
3.4 討論
3.5 小結(jié)
4 楊梅'荸薺'和'東魁'雜交群體高密度遺傳圖譜的構(gòu)建
4.1 材料與方法
4.1.1 試驗材料和DNA提取
4.1.2 文庫構(gòu)建和RAD測序
4.1.3 SNP標(biāo)記確定和基因分型
4.1.4 SSR基因型獲得
4.1.5 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建
4.2 結(jié)果與分析
4.2.1 RAD-seq測序結(jié)果
4.2.2 SNP標(biāo)記多態(tài)性分析和分離檢測
4.2.3 楊梅高密度遺傳圖譜的構(gòu)建
4.3 討論
4.3.1 楊梅高密度遺傳圖譜構(gòu)建
4.3.2 高密度遺傳圖譜的應(yīng)用
4.3.3 RAD-seq在遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用
4.4 小結(jié)
5 楊梅雌雄株群體遺傳多樣性分析及性別相關(guān)標(biāo)記的確定
5.1 材料和方法
5.1.1 材料和DNA提取
5.1.2 PCR引物來源
5.1.3 PCR反應(yīng)體系和程序
5.2 數(shù)據(jù)分析
5.2.1 遺傳多樣性分析
5.2.2 群體結(jié)構(gòu)分析
5.2.3 分子變異分析（AMOVA）
5.2.4 聚類樹構(gòu)建
5.3 結(jié)果
5.3.1 遺傳多樣性分析
5.3.2 群體結(jié)構(gòu)分析
5.3.3 聚類分析
5.3.4 與性別相關(guān)標(biāo)記的確定
5.4 討論
5.4.1 SSR引物的多態(tài)性和遺傳多樣性
5.4.2 群體結(jié)構(gòu)
5.4.3 聚類分析
5.4.4 楊梅性別決定機制
5.5 小結(jié)
6 基于miRNA深度測序的楊梅性別研究初探
6.1 材料與方法
6.1.1 材料
6.1.2 構(gòu)建小RNA文庫和降解組文庫
6.1.3 鑒定楊梅保守的miRNA和開發(fā)新的miRNA
6.1.4 鑒定楊梅miRNA的靶基因
6.2 結(jié)果
6.2.1 楊梅不同性別花序的小RNA分布
6.2.2 楊梅3個文庫中保守miRNA鑒定
6.2.3 楊梅3個文庫中novel miRNA鑒定
6.2.4 利用降解組確定楊梅miRNA的靶基因及靶基因的功能
6.3 討論
6.4 小結(jié)
7 小結(jié)與展望
7.1 小結(jié)
7.2 創(chuàng)新點
7.3 展望
參考文獻
附錄
作者簡歷及在學(xué)期間所取得的科研成果
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本文編號：
1279525
