發(fā)布時(shí)間：2017-12-09 14:22

  本文關(guān)鍵詞：牛樟芝MVA途徑中基因克隆及轉(zhuǎn)錄組、代謝組研究

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【摘要】：我國(guó)是食、藥用菌生產(chǎn)大國(guó),牛樟芝(Antrodia cinnamomea)是我國(guó)臺(tái)灣著名藥用菌品種,富含三萜、腺苷、多糖等活性物質(zhì),具有增強(qiáng)免疫力、降血糖、抗過(guò)敏、保肝等多種功效。本課題對(duì)牛樟芝遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建、牛樟芝菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、牛樟芝MVA途徑中基因克隆和表達(dá)量以及牛樟芝子實(shí)體、菌絲體轉(zhuǎn)錄組和代謝組進(jìn)行了研究,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)牛樟芝MVA途徑和相關(guān)代謝途徑中物質(zhì)差異、解決牛樟芝工業(yè)生產(chǎn)瓶頸問(wèn)題。主要結(jié)論如下：第一,牛樟芝菌絲體在固體和液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度均呈先上升后下降的趨勢(shì),在28℃,液體培養(yǎng)120 rpm·min,21-28 d時(shí)生物量達(dá)到最佳。收集生長(zhǎng)14d的新鮮牛樟芝菌絲體經(jīng)10 mg·mL-1溶壁酶在30℃酶解4h后,原生質(zhì)體得率達(dá)3.55×105個(gè).mL-1,且再生率達(dá)4.59%；20～40%PEG-CaCl2均可介導(dǎo)牛樟芝原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,當(dāng)40%PEG時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高。用熒光顯微鏡和PCR對(duì)含GFP標(biāo)記及潮霉素抗性的擬轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果證實(shí)該方法可將外源基因整合到牛樟芝基因組中。第二,利用PB實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和RSM實(shí)驗(yàn)篩選液體培養(yǎng)牛樟芝菌絲體生物量培養(yǎng)基和牛樟芝菌絲體富萜培養(yǎng)基。結(jié)果表明,實(shí)際生產(chǎn)中牛樟芝菌絲體生物量最適培養(yǎng)基為35.16 g·L-1葡萄糖,42.86 g·L-1麥芽糖,20.80 g·L-1酵母提取物,0.39g·L-1VB1,0.85 g·L-1殼聚糖,當(dāng)溫度為28℃,轉(zhuǎn)速為120 rpm·min-1,培養(yǎng)15d后菌絲體生物量為1.6765±0.0103 g·100 mL-1 (DW);篩選牛樟芝菌絲體富萜最適培養(yǎng)基為：10.32 g·L-1葡萄糖,42.58 g·L-1麥芽糖,15.37 g·L-1蛋白胨,1.12 g·L-1MgSO4,0.63 g·L-1KH2PO4,0.55 g-L1菌草靈芝水提取物(JCGLWE),當(dāng)溫度為28℃,轉(zhuǎn)速為120rpm·min-1,培養(yǎng)15d后菌絲體三萜含量為34.03±1.264mg·g-1 (DW).第三,利用簡(jiǎn)并引物對(duì)牛樟芝的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(mvd)和鯊烯環(huán)氧酶(se)基因進(jìn)行RACE擴(kuò)增,gDNA全長(zhǎng)分別為1268 bp和1607 bp,分別內(nèi)含1個(gè)和3個(gè)內(nèi)含子,cDNA序列分別編碼402氨基酸和481氨基酸,并對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析不同形態(tài)及培養(yǎng)階段牛樟芝中mvd和se表達(dá)水平,結(jié)果表明培養(yǎng)7 d后菌絲體中,nvd和se的表達(dá)量均達(dá)到最高,但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì),培養(yǎng)28-42 d后菌絲體中兩基因表達(dá)量趨于穩(wěn)定；菌絲體中三萜含量的測(cè)定結(jié)果表明,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間小于28 d時(shí),菌絲體中三萜含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,且培養(yǎng)28 d時(shí)菌絲體的三萜含量最高,達(dá)39.192±2.025 mg·g-1,僅次于牛樟芝子實(shí)體三萜含量(49.391±2.675mg·g-1),但菌絲體生長(zhǎng)28 d后其三萜含量降低,玉米芯栽培的牛樟芝子實(shí)體三萜含量最低(為11.530±0.733 mg·g-1),各樣品與對(duì)照組間三萜含量差異達(dá)到顯著水平(P0.05)。第四,對(duì)牛樟芝子實(shí)體(樣品1號(hào))、液體培養(yǎng)14d牛樟芝菌絲體(樣品2號(hào))和液體培養(yǎng)28 d牛樟芝菌絲體(樣品3號(hào))的轉(zhuǎn)錄組GO及KEGG分析結(jié)果表明,基因表達(dá)差異分析結(jié)果顯示樣品1號(hào)與樣品2號(hào)間差異基因有324個(gè),富集在83條GO-term中,其中307個(gè)為下調(diào)基因,17個(gè)為上調(diào)基因；樣品1號(hào)和樣品3號(hào)間差異基因有271個(gè),富集在78條GO-term中,其中245個(gè)為下調(diào)基因,26個(gè)為上調(diào)基因；樣品2號(hào)與樣品3號(hào)間存在的差異基因?yàn)?37個(gè),富集在46條GO-term中,其中244個(gè)為上調(diào)基因,93個(gè)為下調(diào)基因。KEGG結(jié)果表明子實(shí)體和菌絲體主要差異代謝途徑集中在碳代謝、氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、糖酵解、氨基酸生物合成等,而菌絲體間的差異代謝主要集中在脂肪酸代謝、NOD受體信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路等。結(jié)果說(shuō)明不同形態(tài)牛樟芝間的碳代謝、氨基酸代謝發(fā)生了異常；而不同培養(yǎng)時(shí)間的菌絲體之間的脂肪酸代謝和各種信號(hào)通路發(fā)生了紊亂,其中以脂肪酸代謝變化最為明顯。此外,從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩出2個(gè)較穩(wěn)定表達(dá)基因作為管家基因,并對(duì)三萜途徑中的差異基因驗(yàn)證。第五,對(duì)牛樟芝子實(shí)體(樣品1號(hào))、液體培養(yǎng)14d牛樟芝菌絲體(樣品2號(hào))和液體培養(yǎng)28 d牛樟芝菌絲體(樣品3號(hào))的代謝組分析結(jié)果表明,樣品1號(hào)與樣品2號(hào)中篩選出正負(fù)離子條件下已鑒定的代謝差異物分別為21種和26種；樣品1號(hào)與樣品3號(hào)中篩選出正負(fù)離子條件下已鑒定的代謝差異物分別為14種和28種；樣品2號(hào)與樣品3號(hào)中篩選出正負(fù)離子條件下已鑒定的代謝差異物分別為20種和29種。子實(shí)體與菌絲體主要代謝差異途徑包括氨基酸合成代謝、碳代謝和糖代謝,兩者間的共同差異代謝物共47種；而菌絲體間主要代謝差異途徑包括氨基酸合成和脂肪酸代謝,兩者間差異代謝物共43種。研究發(fā)現(xiàn),子實(shí)體與菌絲體間在負(fù)離子條件下特有潛在生物標(biāo)記物有糞卟啉Ⅲ二鹽酸鹽(Coproporphyrin III)、NG,NG-二甲基-L-精氨酸(NG,NG-dimethyl-L-arginine)、咪唑(midzaole)、乙�；�葡萄胺脫氫酶(UDP-N-acetylglucosamine )、尿苷二磷酸葡萄糖(Uridine diphosphate glucose)、烏氨酸(Ornithine)6種,不同培養(yǎng)時(shí)間菌絲體之間負(fù)離子條件下特有潛在生物標(biāo)記物為D-半乳糖,苷氨羧酸,p-D-果糖-2-磷酸鹽3種。本文圍繞牛樟芝MVA途徑進(jìn)行相關(guān)研究,通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選、基因克隆及表達(dá)、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等方法綜合探討牛樟芝三萜類化合物合成途徑,研究結(jié)果為進(jìn)一步挖掘牛樟芝三萜合成關(guān)鍵基因提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ),也為工業(yè)化生產(chǎn)牛樟芝菌絲體提供參考。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S567.39
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本文編號(hào)：1270720