發(fā)布時(shí)間：2017-12-10 20:24

  本文關(guān)鍵詞：Z0206生物納米單質(zhì)硒的制備及其抗腸道氧化應(yīng)激的研究

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【摘要】：仔豬的出生、斷奶以及日糧和環(huán)境的變化等極易導(dǎo)致腸道氧化應(yīng)激,進(jìn)而損傷腸道屏障,導(dǎo)致養(yǎng)分消化吸收障礙、仔豬腹瀉等問(wèn)題,嚴(yán)重影響仔豬的生長(zhǎng)性能,降低養(yǎng)豬生產(chǎn)效益。因此,如何通過(guò)營(yíng)養(yǎng)技術(shù)緩解仔豬腸道氧化應(yīng)激是生豬養(yǎng)殖中面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。硒是動(dòng)物必需的一種微量元素,在體內(nèi)最重要的功能是抗氧化作用。無(wú)機(jī)硒的安全閾值窄,易引起動(dòng)物毒性反應(yīng)。而普遍認(rèn)為安全性較高的硒代蛋氨酸可替代蛋氨酸合成蛋白質(zhì),可能導(dǎo)致硒的累積毒性。近年來(lái)的研究表明納米單質(zhì)硒是一種具有高效抗氧化、免疫調(diào)控活性和高安全性的硒形式。已有的化學(xué)方法制備納米單質(zhì)硒穩(wěn)定性差,需要加入分散劑或保護(hù)劑,工序復(fù)雜成本高。本研究旨在通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化合成生物納米單質(zhì)硒,并評(píng)估生物納米單質(zhì)硒抗腸道氧化應(yīng)激的功效。本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的高產(chǎn)多糖、耐硒菌株EnterobactercloacaeZ0206不僅能高效合成富硒蛋白多糖,而且可將亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化成生物納米單質(zhì)硒。因此,本研究首先優(yōu)化E.cloacaeZ0206合成生物納米單質(zhì)硒的條件,初步探討了其合成生物納米單質(zhì)硒的機(jī)制,并對(duì)E.cloacaeZ0206合成的生物納米單質(zhì)硒進(jìn)行特性表征;進(jìn)一步利用小鼠腸道氧化應(yīng)激模型和豬空腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,以硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒為對(duì)照,研究了生物納米單質(zhì)硒抵抗腸道氧化應(yīng)激,保護(hù)腸道屏障的作用:闡明了生物納米單質(zhì)硒通過(guò)激活Nrf2-ARE通路發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1E.claacae Z0206生物納米單質(zhì)硒的制備與特性表征1.1 E.cloacae Z0206生物納米單質(zhì)硒合成。(1)培養(yǎng)基中添加不同濃度亞硒酸鈉顯著抑制E.loacaeZ0206的生長(zhǎng),且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。(2)通過(guò)Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)方程分析發(fā)現(xiàn),E.cloacaeZ0206還原亞硒酸鈉的速率隨著亞硒酸鈉添加量的增加而提高,且亞硒酸鈉適宜添加量為10mM,發(fā)酵時(shí)間約為144h。(3)掃描電鏡、透射電鏡結(jié)合能譜分析發(fā)現(xiàn),E.cloacae Z0206將亞硒酸鈉還原為球狀、納米級(jí)單質(zhì)硒顆粒。上述結(jié)果提示,E.cloacaeZ0206可商效還原亞硒酸鈉并合成生物納米單質(zhì)硒,且亞硒酸鈉添加董為10 mM,發(fā)酵時(shí)間為 144 h。1.2 E.claacae Z0206生物納米單質(zhì)硒的合成機(jī)制。(1)分析E.cloacae Z0206菌體不同組分(胞膜蛋白、胞質(zhì)蛋白和培養(yǎng)基上清蛋白)的亞硒酸鈉還原能力發(fā)現(xiàn),僅胞膜蛋白可還原亞硒酸鈉生成生物納米單質(zhì)硒。(2)通過(guò)iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),亞硒酸鈉對(duì)E.cloacaeZ0206菌體Painter-type反應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響,但顯著提高富馬酸還原酶的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與iTRAQ結(jié)果一致。(3)進(jìn)一步探究了富馬酸還原酶在E.cloacaeZ0206還原亞硒酸鈉過(guò)程中的作用,發(fā)現(xiàn)富馬酸處理可顯著抑制E.cloacaeZ0206還原亞硒酸鈉的效率;敲除富馬酸還原酶基因同樣顯著減低E.cloacae Z0206還原亞硒酸鈉的效率,表明富馬酸還原酶在E.cloacaeZ0206還原亞硒酸鈉過(guò)程中的關(guān)鍵作用。上述結(jié)果提示,E.cloacaeZ0206主要通過(guò)胞膜蛋白富馬酸還原酶將亞硒酸鈉還原為單質(zhì)硒。1.3 E.cloacae Z0206生物納米單質(zhì)硒特性表征。利用第一節(jié)優(yōu)化的合成條件制備生物納米單質(zhì)硒,經(jīng)過(guò)提純,對(duì)其特性進(jìn)行全面表征。結(jié)合透射電鏡、能譜分析和納米粒度分析發(fā)現(xiàn)生物納米單質(zhì)硒是粒徑均勻、單分散的球狀顆粒,粒徑約為80-250 nm,平均粒徑為139.43 ± 7.44 nm;通過(guò)X射線光電子能譜分析確認(rèn)生物納米單質(zhì)硒中硒的價(jià)態(tài)為0價(jià);通過(guò)傅里葉紅外變換光譜分析發(fā)現(xiàn)生物納米單質(zhì)硒表面含有氨基、羧基、羥基、羰基等蛋白質(zhì)、多糖特征性基團(tuán)。上述結(jié)果提示,生物納米單質(zhì)硒是一種粒徑均勻、單分散的球狀納米顆粒,表面包被細(xì)菌合成的蛋白質(zhì)和多糖。2生物納米單質(zhì)硒抗小鼠腸道氧化應(yīng)激的功能研究2.1.小鼠腸道氧化應(yīng)激模型的構(gòu)建。給小鼠腹腔注射不同劑量Diquat(0-100 mg/kg體重),發(fā)現(xiàn)50-100 mg/kg Diquat均可導(dǎo)致小鼠死亡。對(duì)0-25 mg/kg組小鼠組織樣品分析發(fā)現(xiàn),25mg/kgDiquat顯著提高小鼠血清中ALT、AST、DAO活性和DLA含量,表明25 mg/kg Diquat處理可誘導(dǎo)小鼠肝臟和腸道屏障損傷。對(duì)小鼠肝臟和各腸段(十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸)氧化還原狀態(tài)研究發(fā)現(xiàn),25 mg/kg Diquat顯著提高空腸中ROS和MDA含量;但對(duì)肝臟和其他腸段ROS含量影響無(wú)明顯規(guī)律。此外,25 mg/kg Diquat顯著提高空腸中TrxR和GPx活性,而對(duì)肝臟中兩種酶活性無(wú)顯著影響,表明25 mg/kg Diquat處理誘導(dǎo)小鼠空腸發(fā)生抗氧化反應(yīng)。上述結(jié)果提示,腹腔注射25mg/kgDiquat可成功誘導(dǎo)小鼠空腸氧化應(yīng)激,后續(xù)試驗(yàn)以此方法構(gòu)建小鼠腸道氧化應(yīng)激模型,且確定空腸為研究的目標(biāo)組織。2.2生物納米單質(zhì)硒在小鼠上的適宜劑董篩選。以不同劑量生物納米單質(zhì)硒(0-2 mg/kg體重)連續(xù)灌胃小鼠7天,發(fā)現(xiàn)各組小鼠采食量和體重差異并不顯著。生物納米單質(zhì)硒對(duì)小鼠血清中ALT、AST酶活,肝臟和空腸中MDA含量均無(wú)顯著影響,說(shuō)明生物納米單質(zhì)硒未對(duì)小鼠肝臟和空腸造成氧化損傷。對(duì)小鼠空腸中含硒酶GPx和TrxR活性分析發(fā)現(xiàn),生物納米單質(zhì)硒可顯著提高空腸中GPx和TrxR活性,且存在明顯的劑量依賴效應(yīng),且0.5mg/kg劑量可以使GPx和TrxR活性達(dá)到峰值,因此后續(xù)小鼠模型試驗(yàn)生物納米單質(zhì)硒劑董確定為0.5 mg/kg。2.3生物納米單質(zhì)硒抑制小鼠腸道屏障氧化損傷的功能研究。利用上述構(gòu)建的小鼠腸道氧化應(yīng)激模型,以硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒為對(duì)照,研究了生物納米單質(zhì)硒對(duì)小鼠腸道屏障氧化損傷的影響。研究發(fā)現(xiàn),(1)氧化應(yīng)激導(dǎo)致小鼠腸道對(duì)FD4的通透量、血清DAO活性和DLA含量顯著增加,表明腸道氧化應(yīng)激導(dǎo)致腸道屏障嚴(yán)重?fù)p傷;而生物納米單質(zhì)硒預(yù)處理顯著抑制血清FD4、DAO和DLA水平的提高,抑制了腸道屏障的氧化損傷,且效果顯著優(yōu)于硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒。(2)腸道氧化應(yīng)激導(dǎo)致空腸上皮細(xì)胞凋亡,使空腸絨毛萎縮呈現(xiàn)鋸齒狀;生物納米單質(zhì)硒預(yù)處理顯著抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的上皮細(xì)胞凋亡,保護(hù)絨毛形態(tài),且效果顯著優(yōu)于硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒。(3)氧化應(yīng)激組小鼠空腸ROS含量、MDA含量顯著提高,而生物納米單質(zhì)硒預(yù)處理可顯著抑制空腸中ROS和MDA含量增加,保護(hù)空腸氧化還原穩(wěn)態(tài),效果優(yōu)于硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒。(4)氧化應(yīng)激模型組和三種形式硒預(yù)處理組空腸GPx和TrxR活性均顯著高于對(duì)照組,且生物納米單質(zhì)硒預(yù)處理組GPx活性顯著高于其他組,說(shuō)明氧化應(yīng)激導(dǎo)致小鼠空腸產(chǎn)生抗氧化反應(yīng),而生物納米單質(zhì)硒可更高效提高空腸抗氧化酶活性抵抗氧化應(yīng)激。上述結(jié)果提示,生物納米單質(zhì)硒可商效提高抗氧化酶活性,維持腸道氧化還原穩(wěn)態(tài),抑制腸道屏障的氧化損傷,且效果明顯優(yōu)于硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒。3生物納米單質(zhì)硒抗豬腸道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的功能研究3.1生物納米單質(zhì)硒抑制豬腸道上皮細(xì)胞氧化損傷的功能研究。(1)預(yù)實(shí)驗(yàn):確定以60μM Diquat構(gòu)建IPEC-J2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型;確定生物納米單質(zhì)硒、硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒的處理劑量為0.1 μM。(2)以Transwell體外模擬腸道屏障,Diquat處理使上皮細(xì)胞TER值迅速降低,并在7h內(nèi)降至最低,破壞上皮屏障,顯著增加單層上皮細(xì)胞對(duì)FD4的通透量。生物納米單質(zhì)硒預(yù)處理顯著抑制了 TER的降低和FD4通透量的增加,抑制IPEC-J2細(xì)胞屏障的氧化損傷。而硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒對(duì)IPEC-J2細(xì)胞屏障的氧化損傷無(wú)明顯緩解作用。(3)Diquat處理顯著提高Bax和activecaspase-3表達(dá),抑制Bcl-2表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡;生物納米單質(zhì)硒完全抑制Bax和active caspase-3的增加和Bcl-2的減少,抑制細(xì)胞凋亡,效果顯著優(yōu)于硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒。上述結(jié)果提示,生物納米單質(zhì)硒可顯著緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的IPEC-J2細(xì)胞凋亡,抑制上皮細(xì)胞屏障氧化損傷,效果顯著優(yōu)于硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒。3.2生物納米單質(zhì)硒對(duì)豬腸道上皮細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的影響。與對(duì)照組相比,Diquat處理顯著提高細(xì)胞中ROS、PSSG和MDA含量,降低GSH含量并提高GSSG含量。與Diquat組相比,生物納米單質(zhì)硒預(yù)處理顯著降低ROS、PSSG和MDA含量,提高GSH含量并降低GSSG含量,維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。與Diquat組相比,硒代蛋氨酸預(yù)處理顯著降低細(xì)胞ROS、MDA含量,但對(duì)GSH、GSSG和PSSG含量無(wú)顯著影響�；瘜W(xué)合成納米單質(zhì)硒預(yù)處理組與Diquat組差異不顯著。上述結(jié)果提示,生物納米單質(zhì)硒可有效維持IPEC-J2細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài),抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,且效果顯著優(yōu)于硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒。4生物納米單質(zhì)硒抗腸道氧化應(yīng)激的機(jī)制研究4.1腸道上皮細(xì)胞對(duì)生物納米單質(zhì)硒和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒攝取的差異。以香豆素-6分別標(biāo)記生物納米單質(zhì)硒和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPEC-J2細(xì)胞對(duì)生物納米單質(zhì)硒的攝取量呈現(xiàn)時(shí)間依賴性;然而化學(xué)合成納米單質(zhì)硒的攝取量較低,在處理6h后,化學(xué)合成納米單質(zhì)硒攝取量?jī)H為生物納米單質(zhì)硒攝取量的1/10。提示,生物納米單質(zhì)硒的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力顯著優(yōu)于化學(xué)合成納米單質(zhì)硒。4.2生物納米單質(zhì)硒對(duì)Nrf2-ARE通路的影響。(1)Western blot結(jié)果表明,生物納米單質(zhì)硒可提高Nrf2及其下游抗氧化蛋白TrxR-1、NQO-1、HO-1和Trx的表達(dá),同時(shí)顯著提高含硒GPx-1的表達(dá);硒代蛋氨酸顯著提高含硒酶GPx-1、TrxR-1以及Trx的表達(dá);化學(xué)合成納米單質(zhì)硒僅顯著提高TrxR-1的表達(dá)。(2)通過(guò)檢測(cè)酶活性變化驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),生物納米單質(zhì)硒顯著提高NQO-1、HO-1、TrxR和GPx活性,而硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒僅顯著提高含硒酶TrxR和GPx活性。上述結(jié)果提示,生物納米單質(zhì)硒可能通過(guò)激活Nrf2-ARE通路和提高含硒酶的活性發(fā)揮抗氧化作用,而硒代蛋氨酸和化學(xué)合成納米單質(zhì)硒僅作為硒供體提高含硒酶的活性。4.3 Nrf2-ARE通路在生物納米單質(zhì)硒抗氧化功能中的作用。(1)Western blot和免疫熒光分析表明,生物納米單質(zhì)硒對(duì)Nrf2-ARE通路的激活呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng),且0.1μM生物納米單質(zhì)硒可飽和其對(duì)Nrf2-ARE通路的激活作用。(2)對(duì)生物納米單質(zhì)硒不同處理時(shí)間的效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn),生物納米單質(zhì)硒處理6h時(shí),Nrf2下游抗氧化酶和蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值;而Nrf2表達(dá)量在第8h達(dá)到峰值,12h以后開始降低,24 h時(shí)與對(duì)照組差異不顯著。(3)生物納米單質(zhì)硒對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位(Nrf2-ARE通路的激活)的促進(jìn)呈現(xiàn)時(shí)間依賴效應(yīng),且在處理6h時(shí),Nrf2核轉(zhuǎn)位量達(dá)到峰值。(4)進(jìn)一步利用siRNA干擾Nrf2研究發(fā)現(xiàn),干擾Nrf2顯著抑制生物納米單質(zhì)硒抵抗ROS產(chǎn)生和氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的功能。提示,Nrf2-ARE通路對(duì)生物納米單質(zhì)硒抗氧化功能具有關(guān)鍵作用。4.4生物納米單質(zhì)硒激活Nrf2-ARE通路的機(jī)制研究。(1)通過(guò)Westernblot研究發(fā)現(xiàn),生物納米單質(zhì)硒處理顯著提高Nrf2磷酸化水平,提高M(jìn)APKs通路(ERK1/2、JNK和p38)和P13K/AKT通路的磷酸化水平。(2)通過(guò)抑制劑抑制MAPKs通路和PI3K/AKT通路的激活,發(fā)現(xiàn)抑制ERK1/2、p38和AKT磷酸化之后,生物納米單質(zhì)硒對(duì)Nrf2磷酸化作用被顯著抑制;而抑制JNK磷酸化對(duì)Nrf2磷酸化水平無(wú)顯著影響。提示,生物納米單質(zhì)硒通過(guò)激活ERK1/2、p38和AKT通路來(lái)磷酸化Nrf2,進(jìn)而激活Nrf2-ARE通路發(fā)揮抗氧化作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S816

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